【摘要】：研究背景自發(fā)性腦出血(Spontaneous Intracerebralhemorrhage,ICH)是常見的腦血管疾病,占全部腦卒中的15-200%,每年全球發(fā)病人數(shù)超過2百萬。在發(fā)病6個月內,腦出血的死亡率超過40%,而僅有20%的患者能夠獨立生活。但是目前臨床對腦出血缺乏有效的治療措施,這主要是因為對腦出血后繼發(fā)腦損傷的機制還不了解。越來越多的研究示炎癥反應在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中起重要作用。炎癥反應是以炎性細胞和炎性介質在出血部位大腦中的聚集和激活為特征的。炎癥細胞包括血液來源的粒細胞和巨噬細胞,以及腦固有的小膠質細胞、星性細胞和肥大細胞。這些細胞的激活釋放一系列炎性介質,包括細胞因子、化學因子、蛋白激酶、前列腺素和其他的炎性活性物質。在所有的炎癥細胞中,小膠質細胞是第一個對腦損傷作出反應的細胞。激活的小膠質細胞同血液來源的巨噬細胞形態(tài)相似,無法分辨,因此也被稱為腦內的巨噬細胞。研究證實小膠質細胞/巨噬細胞在腦出血早期就被激活,并且釋放一系列的毒性分子,包括細胞因子、化學因子、活性氧簇,環(huán)氧化酶-2、蛋白酶、血紅素加氧酶-1和前列腺素,因此,小膠質細胞/巨噬細胞在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中起重要作用。T細胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain3,Tim-3)是2002發(fā)現(xiàn)的新型免疫調節(jié)分子,特異性的表達在激活的輔助T淋巴細胞-1。研究證實Tim-3也在固有免疫細胞上表達,包括巨噬細胞、肥大細胞和樹突狀細胞。Tim-3在小膠質細胞/巨噬細胞上過度表達,誘導前炎癥細胞因子的產生,如腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),能夠加重炎癥反應,誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷。但是到目前血后腦組織的炎癥反應尚不清楚。因為小膠質細胞/巨噬細胞是誘發(fā)腦炎癥反應和繼發(fā)性腦損傷的關鍵細胞,并且Tim-3可以調節(jié)小膠質細胞/巨噬細胞的功能,我們推測Tim-3可能通過調節(jié)小膠質細胞/巨噬細胞功能參入腦出血后的炎癥反應。這項研究為了證實此假設。第一部分:Tim-3對腦出血后血腫周圍腦組織炎癥反應的實驗研究目的:檢測Tim-3在血腫周圍腦組織中的表達和細胞來源,探討Tim-3在腦出血后腦組織炎癥反應中的作用。方法:用自體血注射法建立野生型(wild type,WT)小鼠和Tim-3基因敲除(Tim-3-/-)小鼠的腦出血模型,分別在操作后12小時和1、3、5、7天測定血腫周圍腦組織中Tim-3的表達、TNF-a和IL-1β的濃度和腦含水量。免疫熒光染色測定Tim-3陽性細胞、星形細胞、中性粒細胞和小膠質細胞/巨噬細胞的數(shù)量。免疫熒光雙染分辨Tim-3表達的細胞來源。ELISA法測定TNF-a和IL-1β的表達。小鼠行為學測定評估神經缺陷的程度。結果:1.Tim-3陽性細胞數(shù)和Tim-3 mRNA在WT腦出血組從出血后12小時開始升高,1天時達高峰,3天時開始下降,與WT對照組比較,Tim-3陽性細胞數(shù)和Tim-3mRNA在各檢測時間點均有顯著性差異(P0.01)。2.免疫熒光雙染技術顯示Tim-3優(yōu)勢表達在CD11b陽性細胞(小膠質細胞/巨噬細胞),較少在MPO陽性細胞(中性粒細胞)中表達,在GFAP陽性細胞(星形細胞)中表達最少。3.IL-1β和TNF-a的濃度在出血后12小時開始升高,1天時達高峰,3天時開始下降,WT腦出血組與WT對照組比較有顯著性差異(P0.01)。血腫周圍腦組織含水量在出血后12小時升高,高峰在1天和3天,然后逐漸下降,WT腦出血組與WT對照組比較有顯著性差異(P0.01)。4.Tim-3的表達與IL-1β、TNF-a的濃度和腦含水量正相關(IL-1β::0.618,P0.001;TNF-a:r=0.610,P0.001;腦含水量:r=0.566,P=0.001)。5.在Tim-3-/-腦出血組小鼠血腫周圍腦組織中IL-1β、TNF-a的濃度顯著下降,同WT腦出血組比較有顯著性差異(Tim-3-/-腦出血組與WT腦出血組比較,IL-1 β : 12 h P0.01;1d P0.05;3 d P0.05;5d P0.05;7d P0.01.TNF-a12h P0.05;Id P0.05;3d P0.01;5d P0.01;7d P0.01)。在各檢測時間點,腦含水量在Tim-3-/-腦出血組也明顯降低(Tim-3-/-ICH組與WT出血組比較,12hP0.01;1dP0.01;3d P0.01;5d P0.01;7d P0.05)。出血后12小時和1天,神經功能缺損評分(neurological deficit scores,NDS在TiM3-/-腦出血組與WT腦出血組比較無差異。在出血后3天時,NDS在Tim-3-/-腦出血組與WT腦出血組比較有降低,但兩者比較無統(tǒng)計學差異。在出血5天和7天時,NDS在Tim-3-/-腦出血組與WT腦出血組比較明顯降低,兩者比較有顯著性差異(P0.05)。6.腦出血后血腫周圍腦組織中星形細胞、中性粒細胞和小膠質細胞/巨噬細胞的數(shù)量均升高,但是高峰出現(xiàn)的時間不同。星形細胞在出血1天時增多,在5天和7天時達高峰。中性粒細胞在12小時增多,高峰在3天,然后逐漸降低。中性粒細胞和星形細胞的數(shù)量在Tim-3-/-腦出血組和WT腦出血組之間無差異。小膠質細胞/巨噬細胞數(shù)量在出血后12小時升高,在1天時達高峰,同Tim-3、IL-1β和TNF-a的變化趨勢相同。Tim-3-/-腦出血組小膠質細胞/巨噬細胞數(shù)量同WT腦出血組比較顯著降低,兩組之間有顯著性差異(0.01)。結論:Tim-3在腦出血后炎癥反應中起重要作用,可能是一種潛在的治療方法。第二部分:Tim-3在腦出血病人全身炎癥反應中的作用目的:研究Tim-3在腦出血病人外周血免疫細胞中的表達及其與腦出血后全身性炎癥反應和腦損傷的關系。方法:60例新發(fā)病的基底節(jié)腦出血的病人和30例健康者納入該研究。根據(jù)發(fā)病12小時的腦出血量,將腦出血病人分為小量腦出血組(出血量30ml,30例)和大量腦出血組(出血量30ml,30例)。流式細胞學技術檢測Tim-3在外周血免疫細胞中的表達。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應測定Tim-3 mRNA在外周血單個核細胞中的表達。出血后1、3和7天的血清白細胞介素-1β,腫瘤壞死因子-a和S-100B蛋白的濃度使用ELISA方法測定。30天的格拉斯哥預后評分(Glasgow outcome scale,GOS)用于評估腦出血病人的恢復情況。結果:1.腦出血后白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)和單核細胞計數(shù)都明顯升高,3天時達高峰,7天時下降。但是白細胞計數(shù)和中性粒細胞計數(shù)在大量腦出血組升高的更加明顯,在各個檢測時間同小量腦出血組比較均有顯著性差異(P0.01)。大量腦出血組的單核細胞計數(shù)在3天和7天時顯著升高,同小量腦出血組比較差異顯著(P0.01)。腦出血后中性粒細胞的比例也有升高,但只在第3天時兩個腦出血組之間有差異(P0.01)。至于單核細胞比例,在兩個腦出血組之間沒有差異。淋巴細胞的變化趨勢同中性粒細胞和單核細胞細胞相反,淋巴細胞的計數(shù)和比例在各個檢測時間點都降低,而在大量腦出血組降低地更加明顯,同小量腦出血組比較有顯著性差異(p0.01)。2.Tim-3在大量腦出血組病人的CD14+細胞中的表達明顯升高,與對照組比較有顯著性差異(T=4.174,P0.001)。Tim-3在大量腦出血病人的CD4+T淋巴細胞上的表達輕度升高,同對照組比較無差異(t=1.674,P=0.10)。Tim-3在大量腦出血病人的CD8+T淋巴細胞上的表達明顯降低,同對照組比較有顯著性差異(t=3.801,P0.001)。3.腦出血后1天,Tim-3 mRNA表達升高,3天時達高峰,7天時下降。在各檢測時間點同對照組比較有顯著性差異(P0.01)。但是Tim-3 mRNA的表達在大量腦出血病人中升高的更加明顯,同小量腦出血組比較有顯著性差異(P0.01)。4.在各檢測時間點腦出血病人的血清IL-1β和TNF-a濃度都明顯升高,同對照組比較有顯著性差異(P0.01);但在大量腦出血組升高的更加明顯,同小量腦出血組比較有顯著性差異(P0.01)。腦出血后7天內血清S-100B蛋白的濃度持續(xù)升高,同樣,在大量腦出血組升高的更加明顯,同小量腦出血組和對照組比較有顯著性差異(P0.01)。5.Tim-3的表達與血清IL-1β、TNF-a、S-100B蛋白的濃度之間存在密切正性相關。(IL-1β:小量腦出血組r=0.498,P0.001;大量腦出血組r=0.511,P0.001。TNF-a:小量腦出血組r=0.59,P0.001;大量腦出血組r=0.682,P0.001。S-100B蛋白:小量腦出血組r=0.508,P0.001;大量腦出血組r=0.477,P0.001)GOS評分與Tim-3 mRNA、IL-1β、TNF-a、S-100B蛋白之間存在明顯的負性相關。(Tim-3 mRNA:小量腦出血組r=0.650,P0.001;大量腦出血組r=0.723,P0.001。IL-1β:小量腦出血組r=0.492,P=0.06;大量腦出血組r=0.497,P=0.005。TNF-a:小量腦出血組r=0.569,P).001;大量腦出血組r=0.637,P0.001。S-100B蛋白:小量腦出血組r=0.508,P=0.004;大量腦出血組r=0.538,P=0.0、02)。結論:Tim-3在CD14+單核細胞上的表達參入了腦出血后炎癥反應,可能會成為一個新的治療目標。
【圖文】：

逑最多，３天時^u始下降。ＷＴ腦出血組同ＷＴ對照組組比較，Ｔｉｍ－３．陽性細胞數(shù)逡逑在各檢測時間點均有顯著性差異（尸＜0．0１）。（圖１－Ａ，Ｂ）在出血后１２小時、１逡逑天、３天、５天和７天，應用ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測血腫周圍腦組織中Ｔｉｍ－３逡逑ｍＲＮＡ的表達。結果顯示Ｔｉｍ－３邋ｍＲＮＡ的變化趨勢同Ｔｉｍ－３陽性細胞變化相同，逡逑ＷＴ腦出血組小鼠的一ＮＡ在出血后１２小時的表達明顯升高，在！天時邐＜逡逑達高峰，在３天時下降，同ＷＴ對照組比較有顯著性差異（尸＜０．０１）。（圖２）。逡逑：■■■■■逡逑■■■■■逡逑１２邋ｈ邐Ｉｄ邐３ｄ邐５ｄ邐７ｄ逡逑Ｔ＾００００＂邐＊＊逡逑｜｜邋３邐０邋ＷＴ邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｉ邋＾邐Ｈ＇．ＶＴ邋ＩＣＨ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５＾００－邐★★逡逑（Ｎ邐＿逡逑Ｍ邋？＊00邋００－逡逑＾邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ逡逑１２邋ｔｉ邐ｉｄ邐３ｄ邐５邐ｄ邐？ｄ逡逑Ｔｉｍｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ逡逑圖１．小鼠腦出血后各檢測時間點Ｔｉｍ－３陽性細胞的表達。Ａ）和Ｂ）：免疫熒光染色顯示逡逑Ｔｉｍ－３陽性細胞數(shù)（Ｙ±Ｓ）在ＷＴ腦出血組從出血后１２小時開始升高，１天時最多，３天時開逡逑始下降，同ＷＴ對照組比較有顯著性差異（＊＊Ｐ＜０．０１）。逡逑２４逡逑

一ＮＡ在出血后１２小時的表達明顯升高，在！天時邐＜逡逑達高峰，在３天時下降，同ＷＴ對照組比較有顯著性差異（尸＜０．０１）。（圖２）。逡逑：■■■■■逡逑■■■■■逡逑１２邋ｈ邐Ｉｄ邐３ｄ邐５ｄ邐７ｄ逡逑Ｔ＾００００＂邐＊＊逡逑｜｜邋３邐０邋ＷＴ邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｉ邋＾邐Ｈ＇．ＶＴ邋ＩＣＨ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５＾００－邐★★逡逑（Ｎ邐＿逡逑Ｍ邋？＊00邋００－逡逑＾邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ逡逑１２邋ｔｉ邐ｉｄ邐３ｄ邐５邐ｄ邐？ｄ逡逑Ｔｉｍｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ逡逑圖１．小鼠腦出血后各檢測時間點Ｔｉｍ－３陽性細胞的表達。Ａ）和Ｂ）：免疫熒光染色顯示逡逑Ｔｉｍ－３陽性細胞數(shù)（Ｙ±Ｓ）在ＷＴ腦出血組從出血后１２小時開始升高，１天時最多，３天時開逡逑始下降，同ＷＴ對照組比較有顯著性差異（＊＊Ｐ＜０．０１）。逡逑２４逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.34

【參考文獻】

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1 王毓琴;楊培增;;T細胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3與免疫調節(jié)的研究進展[J];國際免疫學雜志;2006年02期

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本文編號：2596128