【摘要】：研究背景自發(fā)性腦出血(Spontaneous Intracerebralhemorrhage,ICH)是常見的腦血管疾病,占全部腦卒中的15-200%,每年全球發(fā)病人數(shù)超過2百萬。在發(fā)病6個(gè)月內(nèi),腦出血的死亡率超過40%,而僅有20%的患者能夠獨(dú)立生活。但是目前臨床對(duì)腦出血缺乏有效的治療措施,這主要是因?yàn)閷?duì)腦出血后繼發(fā)腦損傷的機(jī)制還不了解。越來越多的研究示炎癥反應(yīng)在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中起重要作用。炎癥反應(yīng)是以炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)在出血部位大腦中的聚集和激活為特征的。炎癥細(xì)胞包括血液來源的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,以及腦固有的小膠質(zhì)細(xì)胞、星性細(xì)胞和肥大細(xì)胞。這些細(xì)胞的激活釋放一系列炎性介質(zhì),包括細(xì)胞因子、化學(xué)因子、蛋白激酶、前列腺素和其他的炎性活性物質(zhì)。在所有的炎癥細(xì)胞中,小膠質(zhì)細(xì)胞是第一個(gè)對(duì)腦損傷作出反應(yīng)的細(xì)胞。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞同血液來源的巨噬細(xì)胞形態(tài)相似,無法分辨,因此也被稱為腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞。研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在腦出血早期就被激活,并且釋放一系列的毒性分子,包括細(xì)胞因子、化學(xué)因子、活性氧簇,環(huán)氧化酶-2、蛋白酶、血紅素加氧酶-1和前列腺素,因此,小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中起重要作用。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白域分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain3,Tim-3)是2002發(fā)現(xiàn)的新型免疫調(diào)節(jié)分子,特異性的表達(dá)在激活的輔助T淋巴細(xì)胞-1。研究證實(shí)Tim-3也在固有免疫細(xì)胞上表達(dá),包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。Tim-3在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上過度表達(dá),誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,如腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),能夠加重炎癥反應(yīng),誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷。但是到目前血后腦組織的炎癥反應(yīng)尚不清楚。因?yàn)樾∧z質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是誘發(fā)腦炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵細(xì)胞,并且Tim-3可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的功能,我們推測Tim-3可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞功能參入腦出血后的炎癥反應(yīng)。這項(xiàng)研究為了證實(shí)此假設(shè)。第一部分:Tim-3對(duì)腦出血后血腫周圍腦組織炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究目的:檢測Tim-3在血腫周圍腦組織中的表達(dá)和細(xì)胞來源,探討Tim-3在腦出血后腦組織炎癥反應(yīng)中的作用。方法:用自體血注射法建立野生型(wild type,WT)小鼠和Tim-3基因敲除(Tim-3-/-)小鼠的腦出血模型,分別在操作后12小時(shí)和1、3、5、7天測定血腫周圍腦組織中Tim-3的表達(dá)、TNF-a和IL-1β的濃度和腦含水量。免疫熒光染色測定Tim-3陽性細(xì)胞、星形細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的數(shù)量。免疫熒光雙染分辨Tim-3表達(dá)的細(xì)胞來源。ELISA法測定TNF-a和IL-1β的表達(dá)。小鼠行為學(xué)測定評(píng)估神經(jīng)缺陷的程度。結(jié)果:1.Tim-3陽性細(xì)胞數(shù)和Tim-3 mRNA在WT腦出血組從出血后12小時(shí)開始升高,1天時(shí)達(dá)高峰,3天時(shí)開始下降,與WT對(duì)照組比較,Tim-3陽性細(xì)胞數(shù)和Tim-3mRNA在各檢測時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P0.01)。2.免疫熒光雙染技術(shù)顯示Tim-3優(yōu)勢表達(dá)在CD11b陽性細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞),較少在MPO陽性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)中表達(dá),在GFAP陽性細(xì)胞(星形細(xì)胞)中表達(dá)最少。3.IL-1β和TNF-a的濃度在出血后12小時(shí)開始升高,1天時(shí)達(dá)高峰,3天時(shí)開始下降,WT腦出血組與WT對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.01)。血腫周圍腦組織含水量在出血后12小時(shí)升高,高峰在1天和3天,然后逐漸下降,WT腦出血組與WT對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.01)。4.Tim-3的表達(dá)與IL-1β、TNF-a的濃度和腦含水量正相關(guān)(IL-1β::0.618,P0.001;TNF-a:r=0.610,P0.001;腦含水量:r=0.566,P=0.001)。5.在Tim-3-/-腦出血組小鼠血腫周圍腦組織中IL-1β、TNF-a的濃度顯著下降,同WT腦出血組比較有顯著性差異(Tim-3-/-腦出血組與WT腦出血組比較,IL-1 β : 12 h P0.01;1d P0.05;3 d P0.05;5d P0.05;7d P0.01.TNF-a12h P0.05;Id P0.05;3d P0.01;5d P0.01;7d P0.01)。在各檢測時(shí)間點(diǎn),腦含水量在Tim-3-/-腦出血組也明顯降低(Tim-3-/-ICH組與WT出血組比較,12hP0.01;1dP0.01;3d P0.01;5d P0.01;7d P0.05)。出血后12小時(shí)和1天,神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurological deficit scores,NDS在TiM3-/-腦出血組與WT腦出血組比較無差異。在出血后3天時(shí),NDS在Tim-3-/-腦出血組與WT腦出血組比較有降低,但兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在出血5天和7天時(shí),NDS在Tim-3-/-腦出血組與WT腦出血組比較明顯降低,兩者比較有顯著性差異(P0.05)。6.腦出血后血腫周圍腦組織中星形細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的數(shù)量均升高,但是高峰出現(xiàn)的時(shí)間不同。星形細(xì)胞在出血1天時(shí)增多,在5天和7天時(shí)達(dá)高峰。中性粒細(xì)胞在12小時(shí)增多,高峰在3天,然后逐漸降低。中性粒細(xì)胞和星形細(xì)胞的數(shù)量在Tim-3-/-腦出血組和WT腦出血組之間無差異。小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量在出血后12小時(shí)升高,在1天時(shí)達(dá)高峰,同Tim-3、IL-1β和TNF-a的變化趨勢相同。Tim-3-/-腦出血組小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量同WT腦出血組比較顯著降低,兩組之間有顯著性差異(0.01)。結(jié)論:Tim-3在腦出血后炎癥反應(yīng)中起重要作用,可能是一種潛在的治療方法。第二部分:Tim-3在腦出血病人全身炎癥反應(yīng)中的作用目的:研究Tim-3在腦出血病人外周血免疫細(xì)胞中的表達(dá)及其與腦出血后全身性炎癥反應(yīng)和腦損傷的關(guān)系。方法:60例新發(fā)病的基底節(jié)腦出血的病人和30例健康者納入該研究。根據(jù)發(fā)病12小時(shí)的腦出血量,將腦出血病人分為小量腦出血組(出血量30ml,30例)和大量腦出血組(出血量30ml,30例)。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測Tim-3在外周血免疫細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定Tim-3 mRNA在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)。出血后1、3和7天的血清白細(xì)胞介素-1β,腫瘤壞死因子-a和S-100B蛋白的濃度使用ELISA方法測定。30天的格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(Glasgow outcome scale,GOS)用于評(píng)估腦出血病人的恢復(fù)情況。結(jié)果:1.腦出血后白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)都明顯升高,3天時(shí)達(dá)高峰,7天時(shí)下降。但是白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在大量腦出血組升高的更加明顯,在各個(gè)檢測時(shí)間同小量腦出血組比較均有顯著性差異(P0.01)。大量腦出血組的單核細(xì)胞計(jì)數(shù)在3天和7天時(shí)顯著升高,同小量腦出血組比較差異顯著(P0.01)。腦出血后中性粒細(xì)胞的比例也有升高,但只在第3天時(shí)兩個(gè)腦出血組之間有差異(P0.01)。至于單核細(xì)胞比例,在兩個(gè)腦出血組之間沒有差異。淋巴細(xì)胞的變化趨勢同中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞細(xì)胞相反,淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)和比例在各個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)都降低,而在大量腦出血組降低地更加明顯,同小量腦出血組比較有顯著性差異(p0.01)。2.Tim-3在大量腦出血組病人的CD14+細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高,與對(duì)照組比較有顯著性差異(T=4.174,P0.001)。Tim-3在大量腦出血病人的CD4+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)輕度升高,同對(duì)照組比較無差異(t=1.674,P=0.10)。Tim-3在大量腦出血病人的CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)明顯降低,同對(duì)照組比較有顯著性差異(t=3.801,P0.001)。3.腦出血后1天,Tim-3 mRNA表達(dá)升高,3天時(shí)達(dá)高峰,7天時(shí)下降。在各檢測時(shí)間點(diǎn)同對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.01)。但是Tim-3 mRNA的表達(dá)在大量腦出血病人中升高的更加明顯,同小量腦出血組比較有顯著性差異(P0.01)。4.在各檢測時(shí)間點(diǎn)腦出血病人的血清IL-1β和TNF-a濃度都明顯升高,同對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.01);但在大量腦出血組升高的更加明顯,同小量腦出血組比較有顯著性差異(P0.01)。腦出血后7天內(nèi)血清S-100B蛋白的濃度持續(xù)升高,同樣,在大量腦出血組升高的更加明顯,同小量腦出血組和對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.01)。5.Tim-3的表達(dá)與血清IL-1β、TNF-a、S-100B蛋白的濃度之間存在密切正性相關(guān)。(IL-1β:小量腦出血組r=0.498,P0.001;大量腦出血組r=0.511,P0.001。TNF-a:小量腦出血組r=0.59,P0.001;大量腦出血組r=0.682,P0.001。S-100B蛋白:小量腦出血組r=0.508,P0.001;大量腦出血組r=0.477,P0.001)GOS評(píng)分與Tim-3 mRNA、IL-1β、TNF-a、S-100B蛋白之間存在明顯的負(fù)性相關(guān)。(Tim-3 mRNA:小量腦出血組r=0.650,P0.001;大量腦出血組r=0.723,P0.001。IL-1β:小量腦出血組r=0.492,P=0.06;大量腦出血組r=0.497,P=0.005。TNF-a:小量腦出血組r=0.569,P).001;大量腦出血組r=0.637,P0.001。S-100B蛋白:小量腦出血組r=0.508,P=0.004;大量腦出血組r=0.538,P=0.0、02)。結(jié)論:Tim-3在CD14+單核細(xì)胞上的表達(dá)參入了腦出血后炎癥反應(yīng),可能會(huì)成為一個(gè)新的治療目標(biāo)。
【圖文】：

逑最多，３天時(shí)^u始下降。ＷＴ腦出血組同ＷＴ對(duì)照組組比較，Ｔｉｍ－３．陽性細(xì)胞數(shù)逡逑在各檢測時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異（尸＜0．0１）。（圖１－Ａ，Ｂ）在出血后１２小時(shí)、１逡逑天、３天、５天和７天，應(yīng)用ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ方法檢測血腫周圍腦組織中Ｔｉｍ－３逡逑ｍＲＮＡ的表達(dá)。結(jié)果顯示Ｔｉｍ－３邋ｍＲＮＡ的變化趨勢同Ｔｉｍ－３陽性細(xì)胞變化相同，逡逑ＷＴ腦出血組小鼠的一ＮＡ在出血后１２小時(shí)的表達(dá)明顯升高，在！天時(shí)邐＜逡逑達(dá)高峰，在３天時(shí)下降，同ＷＴ對(duì)照組比較有顯著性差異（尸＜０．０１）。（圖２）。逡逑：■■■■■逡逑■■■■■逡逑１２邋ｈ邐Ｉｄ邐３ｄ邐５ｄ邐７ｄ逡逑Ｔ＾００００＂邐＊＊逡逑｜｜邋３邐０邋ＷＴ邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｉ邋＾邐Ｈ＇．ＶＴ邋ＩＣＨ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５＾００－邐★★逡逑（Ｎ邐＿逡逑Ｍ邋？＊00邋００－逡逑＾邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ逡逑１２邋ｔｉ邐ｉｄ邐３ｄ邐５邐ｄ邐？ｄ逡逑Ｔｉｍｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ逡逑圖１．小鼠腦出血后各檢測時(shí)間點(diǎn)Ｔｉｍ－３陽性細(xì)胞的表達(dá)。Ａ）和Ｂ）：免疫熒光染色顯示逡逑Ｔｉｍ－３陽性細(xì)胞數(shù)（Ｙ±Ｓ）在ＷＴ腦出血組從出血后１２小時(shí)開始升高，１天時(shí)最多，３天時(shí)開逡逑始下降，同ＷＴ對(duì)照組比較有顯著性差異（＊＊Ｐ＜０．０１）。逡逑２４逡逑

一ＮＡ在出血后１２小時(shí)的表達(dá)明顯升高，在！天時(shí)邐＜逡逑達(dá)高峰，在３天時(shí)下降，同ＷＴ對(duì)照組比較有顯著性差異（尸＜０．０１）。（圖２）。逡逑：■■■■■逡逑■■■■■逡逑１２邋ｈ邐Ｉｄ邐３ｄ邐５ｄ邐７ｄ逡逑Ｔ＾００００＂邐＊＊逡逑｜｜邋３邐０邋ＷＴ邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｉ邋＾邐Ｈ＇．ＶＴ邋ＩＣＨ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５＾００－邐★★逡逑（Ｎ邐＿逡逑Ｍ邋？＊00邋００－逡逑＾邋１邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ逡逑１２邋ｔｉ邐ｉｄ邐３ｄ邐５邐ｄ邐？ｄ逡逑Ｔｉｍｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｐｅｒａｔｉｏｎ逡逑圖１．小鼠腦出血后各檢測時(shí)間點(diǎn)Ｔｉｍ－３陽性細(xì)胞的表達(dá)。Ａ）和Ｂ）：免疫熒光染色顯示逡逑Ｔｉｍ－３陽性細(xì)胞數(shù)（Ｙ±Ｓ）在ＷＴ腦出血組從出血后１２小時(shí)開始升高，１天時(shí)最多，３天時(shí)開逡逑始下降，同ＷＴ對(duì)照組比較有顯著性差異（＊＊Ｐ＜０．０１）。逡逑２４逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王毓琴;楊培增;;T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3與免疫調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J];國際免疫學(xué)雜志;2006年02期

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本文編號(hào)：2596128