【摘要】：帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一種多發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性疾病,以運(yùn)動(dòng)不能、肌僵直、靜止性震顫及姿勢(shì)反射障礙為特征性表現(xiàn),其病理學(xué)特征為中腦黑質(zhì)致密帶(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元選擇性缺失。目前,PD的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但普遍認(rèn)為與遺傳因素以及氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡、環(huán)境因素和鐵聚積等非遺傳因素有關(guān)。研究證明,黑質(zhì)(substantia nigra,SN)鐵的聚積是導(dǎo)致DA損傷的重要原因,因此,維持細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)控制疾病的發(fā)生發(fā)展尤為重要。鐵調(diào)素(Hepcidin)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵離子濃度的激素樣物質(zhì),對(duì)維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。當(dāng)機(jī)體處于缺鐵狀態(tài)時(shí),激活的hepcidin促進(jìn)了小腸鐵的攝取,增加細(xì)胞的鐵含量;相反,當(dāng)機(jī)體鐵含量升高時(shí),hepcidin減少,減弱了過量的鐵對(duì)細(xì)胞的損傷。Hepcidin的生理功能是與細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)出蛋白ferroportin1(Fpn1)結(jié)合,使Fpn1發(fā)生內(nèi)化降解,減少膜上的Fpn1從而抑制鐵的外排。因此,hepcidin表達(dá)升高可造成細(xì)胞內(nèi)鐵聚積,沒有外排的鐵離子在細(xì)胞內(nèi)通過Fenton反應(yīng),刺激氧化應(yīng)激的發(fā)生從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷。目前,臨床上并沒有真正成熟有效的藥物來(lái)阻止或者逆轉(zhuǎn)PD發(fā)病過程中細(xì)胞的損傷和死亡,因此,尋找高效、低毒、副作用小的抗PD臨床藥物成為現(xiàn)在新的研究熱點(diǎn)。楊梅黃酮(Myricetin)是提取于楊梅枝葉以及樹皮的天然黃酮類化合物。如今,黃酮類化合物的抗氧化、抗炎癥、抗癌癥作用引起了人們的廣泛關(guān)注。前期研究中,楊梅黃酮已被證明具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抗氧化、抗凋亡有關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,楊梅黃酮可以拮抗慢性應(yīng)激引起的抑郁行為以及學(xué)習(xí)與記憶功能減退,但是其確切的保護(hù)機(jī)制尚不明確。有研究表明,楊梅黃酮可抑制hepcidin的表達(dá),而hepcidin的分泌可以導(dǎo)致細(xì)胞鐵聚積,提示楊梅黃酮可能通過抑制hepcidin的產(chǎn)生,從而對(duì)PD起到保護(hù)作用。但是楊梅黃酮對(duì)PD的保護(hù)作用是否通過抑制hepcidin的生成而實(shí)現(xiàn),其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用神經(jīng)毒性藥物魚藤酮損傷多巴胺能MES23.5細(xì)胞來(lái)制備PD模型,魚藤酮能夠作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ導(dǎo)致細(xì)胞的線粒體損傷,進(jìn)而引起神經(jīng)元死亡。綜合應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazoliurn,MTT)法、流式細(xì)胞分析技術(shù)(flow cytometry,FCM)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)、激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)、western blot等多項(xiàng)研究方法,探討楊梅黃酮對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能MES23.5細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.不同濃度的魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h,經(jīng)MTT檢測(cè),400 n M魚藤酮處理后細(xì)胞生存率為66.1%,與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P?0.001)。不同濃度的楊梅黃酮(10~-1111 M-10~-44 M)處理后,與400 nM魚藤酮相比,其中10~-66 M的楊梅黃酮保護(hù)作用最為顯著(P?0.001),同時(shí)10~-1010 M與10~-55 M的楊梅黃酮的保護(hù)作用僅次于10~(-6)M,保護(hù)作用具有顯著性差異(P?0.01)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們選取400 nM的魚藤酮以及10~-66 M的楊梅黃酮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后,應(yīng)用熒光劑羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial transmembrane potential,Δψm)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,魚藤酮處理組細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.001),而10~-66 M的楊梅黃酮保護(hù)組可部分逆轉(zhuǎn)這一作用,與魚藤酮組相比,線粒體膜電位差升高9.4%,差異具有顯著性(P?0.01)。3.400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxide species,ROS)水平升高,是對(duì)照組的2.5倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.001)。10~-66 M的楊梅黃酮處理可部分逆轉(zhuǎn)魚藤酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.05)。4.400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定hepcidin mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示hepcidin m RNA水平與對(duì)照組相比上調(diào)了1.5倍,差異具有顯著性(P?0.001)。而10~-66 M的楊梅黃酮可以部分逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果,與魚藤酮組相比,楊梅黃酮處理組mRNA水平下降了39.6%,差異具有顯著性(P?0.05)。5.利用熒光染料calcein結(jié)合金屬離子后熒光淬滅的特性來(lái)檢測(cè)細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)出能力,結(jié)果顯示,400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后激光共聚焦顯微鏡顯示的熒光強(qiáng)度顯著降低,與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而10~(-6) M的楊梅黃酮可以部分逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果,其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)與魚藤酮組相比差異具有顯著性。6.400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Fpn1 mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示Fpn1 mRNA水平與對(duì)照組相比降低了38.3%,差異具有顯著性(P?0.001)。而10~(-6) M的楊梅黃酮抑制魚藤酮引起的Fpn1 mRNA表達(dá)的降低,與魚藤酮組相比,Fpn1 mRNA的表達(dá)提高了35.9%,差異具有顯著性(P?0.05)。7.400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后,western blot測(cè)定Fpn1的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,魚藤酮組Fpn1的蛋白表達(dá)降低了34.7%,差異具有顯著性(P?0.01)。而10~(-6) M的楊梅黃酮處理可抑制Fpn1蛋白表達(dá)的降低,與魚藤酮組相比,Fpn1蛋白表達(dá)升高了48.3%,差異具有顯著性(P?0.05)。8.400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后,western blot檢測(cè)p-STAT3的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,魚藤酮組的p-STAT3蛋白水平較對(duì)照組升高了47.9%,差異具有顯著性(P?0.001)。10~(-6) M的楊梅黃酮處理可顯著拮抗魚藤酮引起的p-STAT3蛋白的升高,與魚藤酮組相比,p-STAT3的蛋白表達(dá)下降了28.2%,差異具有顯著性(P?0.001)。9.400 nM魚藤酮處理MES23.5細(xì)胞24 h后,western blot測(cè)定p-SMAD1/5/9的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,p-SMAD1/5/9的蛋白水平上升42.5%,與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P?0.01)。10~-66 M的楊梅黃酮處理可顯著抑制p-SMAD1/5/9的升高,與魚藤酮組相比,p-SMAD1/5/9的蛋白表達(dá)降低了23.2%,差異具有顯著性(P?0.05)。以上結(jié)果表明,楊梅黃酮對(duì)魚藤酮造成的MES23.5細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過激活JAK-STAT和BMP-SMAD信號(hào)通路,抑制hepcidin表達(dá),增強(qiáng)鐵轉(zhuǎn)出相關(guān)。另外,楊梅黃酮也可以直接抑制魚藤酮造成的細(xì)胞內(nèi)ROS的增加,保護(hù)細(xì)胞線粒體的功能,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究不僅為楊梅黃酮的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且為黃酮類藥物的新用途和進(jìn)一步研發(fā)出臨床防治PD的新藥提供參考。
【圖文】：

結(jié)果17圖1 不同濃度的魚藤酮和楊梅黃酮對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of rotenone and myricetin on cell viability(A) Effect of different concentrations of rotenone on MES23.5 cells. 400 nM rotenone decreased thecell viability to 66.1% of control (*P 0.05,**P 0.01,***P 0.001, n=6). (B) Effect of differentconcentrations of myricetin on MES23.5 cells (**P<0.01, n=6). (C) The protective effects of differentconcentrations of myricetin on rotenone-induced MES23.5 cells. 400 nM rotenone significantlydecreased cell viability. 10-6M myricetin significantly inhibited this decrease (***P 0.001, comparedwith the control;##P<0.01,##P<0.001, compared with rotenone treatment group; n=6)

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文梅黃酮拮抗魚藤酮誘導(dǎo)的 MES23.5 細(xì)胞 Δψm 的降低m 在一定程度上可以反映線粒體的功能，當(dāng)細(xì)胞遭受外源刺激時(shí)，障礙，，Δψm 下降。400 nM 的魚藤酮處理 MES23.5 細(xì)胞 24 h 后，Δψ組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.001）；10-6M 的楊梅黃酮共處理顯著的 MES23.5 細(xì)胞 Δψm 的降低（P 0.05）（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2594903