【摘要】：缺血性腦血管疾病(Ischemic cerebrovascular disease,ICVD)是中老年人的常見病和多發(fā)病,占全部腦卒中的80%。腦對(duì)缺氧敏感,不僅缺血缺氧造成嚴(yán)重的局部腦組織損害和功能損害,恢復(fù)血流灌注后腦缺血再灌注損傷會(huì)使缺血性損傷加重轉(zhuǎn)變成不可逆性損傷。缺血性腦血管疾病常常會(huì)損害患者的認(rèn)知功能,引起感覺功能障礙、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙、精神意識(shí)異常,出現(xiàn)判斷能力改變、智商得分降低、記憶能力衰減、人格類型改變、抑郁等。海馬與學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能關(guān)系最為密切,腦缺血再灌注導(dǎo)致海馬神經(jīng)元嚴(yán)重受損,尤其是氧化應(yīng)激損傷及神經(jīng)元凋亡增加,可能是認(rèn)知功能障礙的主要原因。丁苯酞是從食用植物芹菜籽中提取的有效成分,化學(xué)名為消旋-3-正丁基苯酞,于2002年被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療缺血性中風(fēng),許多臨床研究表明,丁苯酞不僅改善了缺血性中風(fēng)的癥狀,而且還有助于長(zhǎng)期康復(fù)。丁苯酞治療缺血性中風(fēng)的潛在機(jī)制,可能與其從多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注損傷后大鼠認(rèn)知功能的影響,以及氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙在其機(jī)制中的作用目前研究報(bào)道尚少。目的:本研究采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注模型,觀察丁苯酞對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能、認(rèn)知功能的改善作用,初步探討丁苯酞是否通過減輕氧化應(yīng)激損傷、改善線粒體功能來發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。方法:選取成年健康雄性SD大鼠80只隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組、低劑量丁苯酞治療組和高劑量丁苯酞治療組。采用線栓缺血2小時(shí)后再灌注法建立大鼠腦缺血再灌注模型,假手術(shù)組則不插入線栓。造模后所有存活大鼠全部納入實(shí)驗(yàn),第2天治療組分別采用低劑量40 mg/kg丁苯酞、高劑量80 mg/kg丁苯酞灌胃治療,每天1次,持續(xù)給藥7天,假手術(shù)組與模型組則給予等體積的玉米油。在大鼠治療7天后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分(Longa法),術(shù)后1個(gè)月左右對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,采用Morris水迷宮進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的空間學(xué)習(xí)能力、空間記憶能力。通過HE染色測(cè)定大鼠腦部海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化,TUNEL染色、大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3/Caspase-9表達(dá)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。分離海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞通過JC-1染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化,DCFH-DA熒光染色檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)活性氧含量,評(píng)價(jià)線粒體膜電位引起腦缺血大鼠認(rèn)知功能障礙的細(xì)胞凋亡機(jī)制。結(jié)果:(1)通過線栓法成功建立大鼠腦缺血再灌注模型,假手術(shù)組大鼠未發(fā)生神經(jīng)功能缺損,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分最高,低劑量丁苯酞治療組大鼠評(píng)分有下降趨勢(shì),而高劑量丁苯酞治療組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較模型組下降了近40%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)造模1個(gè)月后,大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)能力,歷經(jīng)5天,隨著天數(shù)的增加,各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯逐漸縮短,腦缺血再灌注模型組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期時(shí)間明顯較假手術(shù)組延長(zhǎng)(P0.05);低劑量和高劑量丁苯酞治療組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均明顯低于腦缺血再灌注模型組,并且隨著丁苯酞?jiǎng)┝吭黾?其逃避潛伏期時(shí)間也更短(P0.05)。(3)完成大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)后的第2天進(jìn)行大鼠空間探索實(shí)驗(yàn),檢測(cè)大鼠的空間記憶能力,觀察記錄四組大鼠的目標(biāo)象限停留時(shí)間,發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注模型組明顯低于假手術(shù)組,差異顯著(P0.05);丁苯酞治療組明顯比腦缺血再灌注模型組高,差異顯著(P0.05);高劑量丁苯酞治療組高于低劑量丁苯酞治療組。(4)HE染色觀察腦缺血再灌注后腦組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注模型組細(xì)胞丟失嚴(yán)重,尤其海馬的CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞丟失最為嚴(yán)重。經(jīng)低、高劑量丁苯酞治療后,神經(jīng)元細(xì)胞損傷均出現(xiàn)一定程度減輕,說明丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注后的大鼠海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用。(5)TUNEL染色檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡狀態(tài),發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注模型組TUNEL表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增高,高劑量丁苯酞治療組海馬中TUNEL表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯低于低劑量丁苯酞治療組和腦缺血再灌注模型組,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。(6)提取海馬組織蛋白,Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspa se-9的表達(dá)情況,結(jié)果顯示假手術(shù)組中Caspase-3/Caspase-9低表達(dá),腦缺血再灌注模型組Caspase-3/Caspase-9表達(dá)明顯增高(P0.05),經(jīng)丁苯酞治療后C aspase-3/Caspase-9表達(dá)水平降低,尤其隨著丁苯酞組劑量升高,Caspase-3/Caspase-9表達(dá)降低更為明顯(P0.05)。(7)分離海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行JC-1染色,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化,結(jié)果顯示腦缺血再灌注模型組大鼠細(xì)胞中線粒體膜電位較假手術(shù)組降低了47.7%,丁苯酞治療組可以明顯提高線粒體膜電位,特別是高劑量丁苯酞治療組效果最好,恢復(fù)到了假手術(shù)組的80%(P0.01),說明丁苯酞可以明顯改善腦缺血再灌注損傷對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元的線粒體損傷。(8)DCFH-DA熒光探針標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的ROS,經(jīng)熒光顯微鏡觀察拍照,結(jié)果顯示假手術(shù)組細(xì)胞中只有少量DCFH綠色熒光,而腦缺血再灌注模型組細(xì)胞中DCFH綠色熒光顯著升高,說明ROS產(chǎn)生增加,而使用丁苯酞治療后,綠色熒光強(qiáng)度較模型組明顯減少,具有顯著差異(P0.01),說明丁苯酞可以明顯抑制腦缺血再灌注損傷過程中產(chǎn)生的ROS,減少神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷。結(jié)論:丁苯酞對(duì)于腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能、認(rèn)知功能改善效果突出,特別是大劑量丁苯酞,能夠有效改善神經(jīng)功能評(píng)分、提升治療組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力。同時(shí)丁苯酞可明顯提高腦缺血再灌注損傷大鼠海馬神經(jīng)元的線粒體膜電位,減少腦細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,降低凋亡蛋白Caspase-3/Ca spase-9表達(dá),抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,減少海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元丟失,有利于腦缺血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的功能恢復(fù)。
【圖文】：

詳情見表 3.1、圖3.1 所示。以上說明丁苯酞減少了腦缺血再灌注對(duì)神經(jīng)功能的損傷。表 3.1 四組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分對(duì)比結(jié)果組別 數(shù)量（只） 神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分）假手術(shù)組 18 0.21±0.01腦缺血再灌注模型組 15 2.47±0.52**低劑量丁苯酞治療組 16 1.94±0.44**高劑量丁苯酞治療組 18 1.50±0.51**##注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05,**P＜0.01; 與腦缺血再灌注模型組比較，#P＜0.05,##P＜0.01.圖 3.1 四組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分對(duì)比結(jié)果注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05,**P＜0.01; 與腦缺血再灌注模型組比較，#P＜0.05,##P＜0.01.

圖 3.2 實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)A:大鼠提尾表現(xiàn) B:大鼠畫圈表現(xiàn) C:大鼠傾倒3.2 丁苯酞對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響通過水迷宮進(jìn)行大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)，，歷經(jīng) 5 天，每天測(cè)試 4 次，利用目標(biāo)平臺(tái)的空間位置評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，隨著天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯逐漸縮短，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；對(duì)比四組大鼠空間學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期，腦缺血再灌注模型組各時(shí)間點(diǎn)明顯較假手術(shù)組延長(zhǎng)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；高劑量丁苯酞治療組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間低于低劑量組，也低于腦缺血再灌注模型組，對(duì)比差異顯著(P＜0.05)。詳情見表 3.2、圖3.3 所示。表 3.2 歷經(jīng) 5 天大鼠空間學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期對(duì)比結(jié)果（單位：s）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743

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本文編號(hào)：2591918