【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種多發(fā)于老年人的神經(jīng)退行性疾病,其常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)癥狀有靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直、姿勢(shì)反射障礙等,非運(yùn)動(dòng)癥狀有焦慮、睡眠障礙、認(rèn)知障礙等。近年來(lái),干細(xì)胞研究所取得的成就為PD治療帶來(lái)了新的希望。PD的主要病理特征為中腦黑質(zhì)(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的選擇性缺失。PD的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,但大量研究表明神經(jīng)炎癥在DA能神經(jīng)元變性丟失過(guò)程中起著重要作用。研究表明神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)移植在改善PD神經(jīng)炎癥微環(huán)境中具有重要的作用。嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells,OECs)因其出色的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能經(jīng)常被應(yīng)用于細(xì)胞的聯(lián)合移植中,被稱為移植細(xì)胞的“營(yíng)養(yǎng)泵”。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明OECs在改善移植細(xì)胞炎癥微環(huán)境中起到重要作用。為研究NSCs與OECs聯(lián)合移植對(duì)PD大鼠神經(jīng)功能修復(fù)作用及其機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)將E11~12 d胎鼠中腦來(lái)源的NSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和免疫熒光鑒定,將1~3d新生鼠嗅球來(lái)源的OECs體外培養(yǎng)并進(jìn)行免疫熒光鑒定。移植前用GFP-HIV轉(zhuǎn)染NSCs以標(biāo)記NSCs,用Hoechst 33342標(biāo)記OECs。在成年雄性Wistar大鼠右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束和黑質(zhì)兩點(diǎn)注射6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制備PD模型,造模4 w后選擇造模成功的PD大鼠進(jìn)行紋狀體(striatum,Str)內(nèi)細(xì)胞移植。移植手術(shù)7 d后通過(guò)熒光觀察細(xì)胞移植情況;通過(guò)曠場(chǎng)試驗(yàn)(open field test,OFT)、平衡木實(shí)驗(yàn)和握力測(cè)試檢測(cè)PD大鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力、焦慮程度、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和肌僵直程度;通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot,WB)檢測(cè)PD大鼠Str及SN腦區(qū)中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白的表達(dá)變化和PD大鼠右側(cè)Str腦區(qū)中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)和白介素-4(interleukin 4,IL-4)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果如下:1.NSCs體外培養(yǎng)3代后可見(jiàn)形狀規(guī)則的神經(jīng)球,神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光鑒定呈Nestin陽(yáng)性,分化后的NSCs免疫熒光鑒定為TH陽(yáng)性和GFAP陽(yáng)性。體外培養(yǎng)的OECs呈現(xiàn)雙極和多極的細(xì)胞形態(tài),且大部分細(xì)胞免疫熒光鑒定呈P~(75NTR)陽(yáng)性。2.利用GFP-HIV轉(zhuǎn)染NSCs標(biāo)記NSCs,利用Hoechst 33342標(biāo)記OECs,細(xì)胞絕大多數(shù)被成功標(biāo)記。移植手術(shù)7 d后,對(duì)大鼠腦切片進(jìn)行熒光觀察,對(duì)照組和6-OHDA組均未觀察到熒光,而各細(xì)胞移植組可見(jiàn)與細(xì)胞標(biāo)記物相應(yīng)的熒光,說(shuō)明細(xì)胞移植成功。3.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,6-OHDA組曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離較短(P0.01,n=9-11),說(shuō)明6-OHDA組大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力下降;相比6-OHDA組,聯(lián)合移植組曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離較長(zhǎng)(P0.05,n=9-11),但NSCs或OECs單獨(dú)移植組曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)距離有所增加但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明NSCs與OECs聯(lián)合移植組大鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力短期內(nèi)得到改善。相比對(duì)照組,6-OHDA組平衡木得分降低(P0.001,n=9-11),說(shuō)明6-OHDA組大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力下降;相比6-OHDA組,單獨(dú)移植組或聯(lián)合移植組的平衡木得分均略有上升,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明單獨(dú)移植組或聯(lián)合移植組大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力短期內(nèi)無(wú)改善。相比對(duì)照組,6-OHDA組懸掛持續(xù)時(shí)間增加,說(shuō)明6-OHDA組大鼠肌僵直程度增加(P0.05,n=9-11);相比6-OHDA組,單獨(dú)移植組或聯(lián)合移植組懸掛持續(xù)時(shí)間均略有下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明單獨(dú)移植組或聯(lián)合移植組大鼠肌僵直癥狀短期內(nèi)無(wú)明顯緩解。4.OFT結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,6-OHDA組的曠場(chǎng)外周與中央活動(dòng)時(shí)間比值(Pt/Ct)變大,說(shuō)明6-OHDA組大鼠焦慮程度較高(P0.05,n=9-11),與6-OHDA組相比,OECs移植組和聯(lián)合移植組的Pt/Ct變小,說(shuō)明OECs移植組和NSCs與OECs聯(lián)合移植組的焦慮程度較低(P0.05,n=9-11)。5.PD大鼠左側(cè)Str和SN的TH蛋白表達(dá)均無(wú)變化(P0.05)。右側(cè)Str的TH蛋白表達(dá)變化明顯,與對(duì)照組相比,6-OHDA組、NSCs移植組、OECs移植組和聯(lián)合移植組的TH表達(dá)量均減少(P0.001,n=5-7),而與6-OHDA組相比,NSCs移植組和聯(lián)合移植組的TH表達(dá)量略有增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);右側(cè)SN的TH表達(dá)變化明顯,與對(duì)照組相比,其余四組TH表達(dá)量均減少(P0.001,n=5-7),與6-OHDA組相比,聯(lián)合移植組的TH表達(dá)量略有增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.PD大鼠右側(cè)Str的炎性因子表達(dá)變化明顯。與對(duì)照組相比,6-OHDA組的TNF-α、IL-1β和IL-4表達(dá)量均增加(P0.05,n=5-7)。與6-OHDA組相比,聯(lián)合移植組的TNF-α和IL-1β表達(dá)量減少(P0.05,n=5-7),IL-4的表達(dá)量略有增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);單獨(dú)移植組的IL-1β表達(dá)量減少(P0.05,n=5-7),且TNF-α與IL-4表達(dá)量減少,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,n=5-7)。以上結(jié)果表明,NSCs和OECs聯(lián)合移植7d后PD大鼠的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),焦慮程度降低;促炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)量減少,說(shuō)明聯(lián)合移植短期內(nèi)能促進(jìn)PD大鼠神經(jīng)功能部分修復(fù),其修復(fù)機(jī)制可能與促炎因子的表達(dá)量減少有關(guān)。本研究結(jié)果將為今后應(yīng)用NSCs和OECs聯(lián)合移植治療PD供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋歌;呂月濤;狄林林;宗文納;陳伯旺;;早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)重癥肺炎大鼠免疫功能的影響分析[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

2 葉敏;陳達(dá)柔;陳宇中;杜少冰;杜展鑫;李玉鳳;唐s鉈，

本文編號(hào)：2591102