【摘要】：背景與目的:膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,同時仍是神經系統(tǒng)疾病中的治療難點之一,尤其是惡心程度高的高級別膠質瘤,患者生存率仍處于較低的水平。因此,在細胞、分子水平深入探索膠質瘤發(fā)病、轉歸等方面的機制,以此探尋膠質瘤的治療靶點,為膠質瘤提供新的治療方式,顯得尤為迫切。造血干細胞特異蛋白1-相關蛋白X-1(HAX-1)是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡蛋白,在多種腫瘤細胞中呈過表達狀態(tài),并促進腫瘤細胞的增殖、遷移并抑制腫瘤細胞凋亡。HAX-1蛋白具有多種生物學功能,但在膠質瘤中的研究仍處于空白,本次研究中將以HAX-1為切入點,研究HAX-1膠質瘤增殖和凋亡中的作用,并初步探討HAX-1的作用機制。方法:1.細胞培養(yǎng):培養(yǎng)人神經膠質瘤細胞U118,U87-MG,U251和SHG44,人神經膠質細胞HA。2.免疫組化染色:明確人神經膠質瘤組織中HAX-1的表達情況。3.qPCR技術:檢測神經膠質細胞和神經膠質瘤細胞中HAX-1的轉錄水平變化,神經膠質瘤組織與瘤旁組織中HAX-1轉錄水平的變化;神經膠質瘤細胞U118和U87-MG中p53蛋白轉錄水平的變化。4.Western blot蛋白免疫印跡技術:檢測人膠質瘤組織和瘤旁組織中HAX-1的表達情況;人膠質瘤細胞和人神經膠質細胞中HAX-1的表達情況;膠質瘤細胞U118和U87-MG在HAX-1敲除后的檢測;膠質瘤細胞U118和U87-MG中p21、BAX、p53和Hsp90蛋白的表達情況;膠質瘤細胞U118和U87-MG在氧化應激條件下Caspase9、Caspase3和PARP蛋白激活的情況;膠質瘤細胞U118和U87-MG中p53蛋白的降解速度和泛素化水平;膠質瘤細胞U118和U87-MG中Akt1和MDM-2蛋白的磷酸化水平變化;膠質瘤細胞U118和U87-MG中Akt1與Hsp90相互作用的變化。5.克隆形成試驗:檢測HAX-1敲除前后克隆形成能力的變化。6.Edu細胞增殖實驗:利用Edu標記增殖期細胞以評價在HAX-1敲除前后膠質瘤細胞增殖能力的變化。7.流式細胞周期測定:利用流式細胞儀檢測HAX-1敲除前后膠質瘤細胞U118和U87-MG細胞周期的變化。8.流式細胞凋亡測定:利用流式細胞儀檢測HAX-1敲除前后膠質瘤細胞U118和U87-MG在氧化應激條件下凋亡情況的變化。9.免疫共沉淀:利用免疫共沉淀技術檢測膠質瘤細胞U118和U87-MG中HAX-1與Hsp90蛋白的結合,HAX-1敲除前后膠質瘤細胞U118和U87-MG中p53蛋白泛素化水平的變化,Akt1與Hsp90蛋白間相互作用的變化。10.免疫熒光共定位染色:利用免疫熒光共定位染色檢測在膠質瘤細胞U118和U87-MG中Hsp90,HAX-1和Akt1蛋白在細胞內分布以及共定位情況的變化。結果:通過一系列的實驗以及相關結果的統(tǒng)計分析,我們發(fā)現(xiàn)HAX-1蛋白在膠質瘤組織和細胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài),而且HAX-1的表達與腫瘤體積、分化程度和病理學分級相關,是膠質瘤的獨立預后因素。我們在膠質瘤細胞U118和U87-MG中調控HAX-1表達后發(fā)現(xiàn),HAX-1蛋白敲除后能夠抑制膠質瘤細胞U118和U87-MG克隆形成能力,降低增殖期細胞比例,使U118和U87-MG細胞阻滯于G0/G1期,且導致周期蛋白p21的表達升高。HAX-1蛋白敲除后同樣能夠使膠質瘤細胞U118和U87-MG在過氧化氫模擬氧化應激環(huán)境下凋亡率升高,Caspase9、Caspase3和PARP等凋亡蛋白激活水平升高。相應的,HAX-1敲除后p53蛋白及下游蛋白BAX等凋亡相關蛋白的表達升高。進一步的分析發(fā)現(xiàn),HAX-1蛋白并不影響膠質瘤細胞U118和U87-MG中p53蛋白的轉錄,而是通過影響p53蛋白的泛素化而促進p53蛋白的降解。同時發(fā)現(xiàn)在膠質瘤細胞U118和U87-MG中HAX-1蛋白敲除后p53蛋白的泛素化E3連接酶MDM-2磷酸化水平降低,MDM-2上游蛋白Akt1的磷酸化水平也呈降低趨勢,而過表達HAX-1蛋白后,MDM-2和Akt1的磷酸化水平相應升高。繼而我們驗證了在膠質瘤細胞U118和U87-MG中HAX-1能夠與Hsp90結合,并發(fā)現(xiàn)HAX-1可以通過與Hsp90蛋白的結合促進Hsp90與Akt1蛋白的結合,通過這種方式促進Akt1蛋白的磷酸化水平。使用Hsp90蛋白選擇性抑制劑后,HAX-1蛋白對Akt1、MDM-2蛋白磷酸化水平的促進作用減弱。結論:綜上所述,經過本課題的研究我們發(fā)現(xiàn),HAX-1蛋白導致膠質瘤細胞增殖能力和抗凋亡能力增強。
【圖文】：

圖１．３．１注：ＨＡＸ－１在膠質瘤組織中的表達：Ａ和Ｂ．膠質瘤組織及瘤旁組織病理切片逡逑免疫組織化學染色：使用小鼠ＨＡＸ－１單克隆抗體標記ＨＡＸ－１蛋白，ＨＲＰ標記羊抗鼠多克逡逑隆抗體進行免疫組織化學染色，陽性反應呈橙黃色染色，陰性對照以及瘤旁組織使用蘇木逡逑素進行細胞核復燃，分別于２００倍及４００倍下拍攝染色后組織切片狀態(tài)。如圖所示，陰性逡逑對照組和瘤旁組織染色未見明顯陽性反應，膠質瘤組織中可見大量陽性反應染色。通過逡逑Ｉｍａｇｅ邋ｐｒｏ邋ｐｌｕｓ軟件對圖片染色情況進行分析后統(tǒng)計各組圖片陽性情況，結果如Ｂ所示。Ｃ．逡逑組織標本熒光定量ＰＣＲ：提取腫瘤組織和瘤旁組織ｍＲＮＡ后進行逆轉錄ＰＣＲ合成相應的逡逑ｃＤＮＡ文庫，并通過ＨＡＸ－１特異性引物進行熒光定量ＰＣＲ邋（ｑＰＣＲ）檢測ＨＡＸ－】轉錄情況，逡逑結果如圖所示：腫瘤組織中ＨＡＸ－１的轉錄明顯高于瘤旁組織。Ｄ．組織標本Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋逡逑白免疫印跡檢測：提取腫瘤組織和瘤旁組織總蛋白后，通過Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白免疫印跡技術逡逑檢測腫瘤組織和瘤旁組織中ＨＡＸ－１蛋白，結果如圖所示，腫瘤組織中ＨＡＸ－］蛋白的表達逡逑水平明顯高于瘤旁組織。Ｎ即Ｎｏｎｃａｎｃｅｒｏｕｓ，瘤旁組織；Ｔ即Ｔｕｍｏｒ，腫瘤組織。＊＊／■＜０．０１，，逡逑＊＊＊＊？＜邋０．０００１逡逑１４逡逑

圖２．３．２注：ＨＡＸ－１敲除后導致膠質瘤細胞周期阻滯：Ａ．流式細胞技術分析細胞周期：逡逑采用ＣＲ丨ＳＰＲ／Ｃａｓ９技術在膠質瘤細胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ中敲除ＨＡＸ－丨基因后，通過ＰＩ染逡逑色并采用流式細胞技術，檢測ＨＡＸ－１敲除前后膠質瘤細胞的細胞周期分布情況。結果如圖逡逑所示，ＨＡＸ－丨敲除后膠質瘤細胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ阻滯于Ｇ０／Ｇ丨期。Ｂ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白免逡逑疫印跡技術檢測ｐ２１蛋白的表達：采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術在膠質瘤細胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ逡逑中敲除ＨＡＸ－１基因后，提�。龋粒兀鼻贸昂蟮模眨保保负停眨福罚停羌毎偟鞍�，并通過Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ蛋白免疫印跡技術檢測器中ｐ２１蛋白的表達情況。以ＧＡＰＤＨ蛋白作為內參蛋白，反應逡逑總蛋白量。結果如圖所示，ＨＡＸ－１敲除后，ｐ２１蛋白在Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ細胞中表達量升高。逡逑＊尸邋＜０．０５，邋＊＊＊＊／■邋＜０．０００１逡逑３１逡逑
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

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本文編號：2591073