【摘要】：背景與目的:膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,同時(shí)仍是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療難點(diǎn)之一,尤其是惡心程度高的高級(jí)別膠質(zhì)瘤,患者生存率仍處于較低的水平。因此,在細(xì)胞、分子水平深入探索膠質(zhì)瘤發(fā)病、轉(zhuǎn)歸等方面的機(jī)制,以此探尋膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn),為膠質(zhì)瘤提供新的治療方式,顯得尤為迫切。造血干細(xì)胞特異蛋白1-相關(guān)蛋白X-1(HAX-1)是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡蛋白,在多種腫瘤細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài),并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。HAX-1蛋白具有多種生物學(xué)功能,但在膠質(zhì)瘤中的研究仍處于空白,本次研究中將以HAX-1為切入點(diǎn),研究HAX-1膠質(zhì)瘤增殖和凋亡中的作用,并初步探討HAX-1的作用機(jī)制。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118,U87-MG,U251和SHG44,人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA。2.免疫組化染色:明確人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中HAX-1的表達(dá)情況。3.qPCR技術(shù):檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HAX-1的轉(zhuǎn)錄水平變化,神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織與瘤旁組織中HAX-1轉(zhuǎn)錄水平的變化;神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中p53蛋白轉(zhuǎn)錄水平的變化。4.Western blot蛋白免疫印跡技術(shù):檢測(cè)人膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織中HAX-1的表達(dá)情況;人膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中HAX-1的表達(dá)情況;膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG在HAX-1敲除后的檢測(cè);膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中p21、BAX、p53和Hsp90蛋白的表達(dá)情況;膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG在氧化應(yīng)激條件下Caspase9、Caspase3和PARP蛋白激活的情況;膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中p53蛋白的降解速度和泛素化水平;膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中Akt1和MDM-2蛋白的磷酸化水平變化;膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中Akt1與Hsp90相互作用的變化。5.克隆形成試驗(yàn):檢測(cè)HAX-1敲除前后克隆形成能力的變化。6.Edu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):利用Edu標(biāo)記增殖期細(xì)胞以評(píng)價(jià)在HAX-1敲除前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的變化。7.流式細(xì)胞周期測(cè)定:利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HAX-1敲除前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG細(xì)胞周期的變化。8.流式細(xì)胞凋亡測(cè)定:利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HAX-1敲除前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG在氧化應(yīng)激條件下凋亡情況的變化。9.免疫共沉淀:利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中HAX-1與Hsp90蛋白的結(jié)合,HAX-1敲除前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中p53蛋白泛素化水平的變化,Akt1與Hsp90蛋白間相互作用的變化。10.免疫熒光共定位染色:利用免疫熒光共定位染色檢測(cè)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中Hsp90,HAX-1和Akt1蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布以及共定位情況的變化。結(jié)果:通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析,我們發(fā)現(xiàn)HAX-1蛋白在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),而且HAX-1的表達(dá)與腫瘤體積、分化程度和病理學(xué)分級(jí)相關(guān),是膠質(zhì)瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。我們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中調(diào)控HAX-1表達(dá)后發(fā)現(xiàn),HAX-1蛋白敲除后能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG克隆形成能力,降低增殖期細(xì)胞比例,使U118和U87-MG細(xì)胞阻滯于G0/G1期,且導(dǎo)致周期蛋白p21的表達(dá)升高。HAX-1蛋白敲除后同樣能夠使膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG在過(guò)氧化氫模擬氧化應(yīng)激環(huán)境下凋亡率升高,Caspase9、Caspase3和PARP等凋亡蛋白激活水平升高。相應(yīng)的,HAX-1敲除后p53蛋白及下游蛋白BAX等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)升高。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),HAX-1蛋白并不影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中p53蛋白的轉(zhuǎn)錄,而是通過(guò)影響p53蛋白的泛素化而促進(jìn)p53蛋白的降解。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中HAX-1蛋白敲除后p53蛋白的泛素化E3連接酶MDM-2磷酸化水平降低,MDM-2上游蛋白Akt1的磷酸化水平也呈降低趨勢(shì),而過(guò)表達(dá)HAX-1蛋白后,MDM-2和Akt1的磷酸化水平相應(yīng)升高。繼而我們驗(yàn)證了在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118和U87-MG中HAX-1能夠與Hsp90結(jié)合,并發(fā)現(xiàn)HAX-1可以通過(guò)與Hsp90蛋白的結(jié)合促進(jìn)Hsp90與Akt1蛋白的結(jié)合,通過(guò)這種方式促進(jìn)Akt1蛋白的磷酸化水平。使用Hsp90蛋白選擇性抑制劑后,HAX-1蛋白對(duì)Akt1、MDM-2蛋白磷酸化水平的促進(jìn)作用減弱。結(jié)論:綜上所述,經(jīng)過(guò)本課題的研究我們發(fā)現(xiàn),HAX-1蛋白導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力和抗凋亡能力增強(qiáng)。
【圖文】：

圖１．３．１注：ＨＡＸ－１在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)：Ａ和Ｂ．膠質(zhì)瘤組織及瘤旁組織病理切片逡逑免疫組織化學(xué)染色：使用小鼠ＨＡＸ－１單克隆抗體標(biāo)記ＨＡＸ－１蛋白，ＨＲＰ標(biāo)記羊抗鼠多克逡逑隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，陽(yáng)性反應(yīng)呈橙黃色染色，陰性對(duì)照以及瘤旁組織使用蘇木逡逑素進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)燃，分別于２００倍及４００倍下拍攝染色后組織切片狀態(tài)。如圖所示，陰性逡逑對(duì)照組和瘤旁組織染色未見明顯陽(yáng)性反應(yīng)，膠質(zhì)瘤組織中可見大量陽(yáng)性反應(yīng)染色。通過(guò)逡逑Ｉｍａｇｅ邋ｐｒｏ邋ｐｌｕｓ軟件對(duì)圖片染色情況進(jìn)行分析后統(tǒng)計(jì)各組圖片陽(yáng)性情況，結(jié)果如Ｂ所示。Ｃ．逡逑組織標(biāo)本熒光定量ＰＣＲ：提取腫瘤組織和瘤旁組織ｍＲＮＡ后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄ＰＣＲ合成相應(yīng)的逡逑ｃＤＮＡ文庫(kù)，并通過(guò)ＨＡＸ－１特異性引物進(jìn)行熒光定量ＰＣＲ邋（ｑＰＣＲ）檢測(cè)ＨＡＸ－】轉(zhuǎn)錄情況，逡逑結(jié)果如圖所示：腫瘤組織中ＨＡＸ－１的轉(zhuǎn)錄明顯高于瘤旁組織。Ｄ．組織標(biāo)本Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋逡逑白免疫印跡檢測(cè)：提取腫瘤組織和瘤旁組織總蛋白后，通過(guò)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白免疫印跡技術(shù)逡逑檢測(cè)腫瘤組織和瘤旁組織中ＨＡＸ－１蛋白，結(jié)果如圖所示，腫瘤組織中ＨＡＸ－］蛋白的表達(dá)逡逑水平明顯高于瘤旁組織。Ｎ即Ｎｏｎｃａｎｃｅｒｏｕｓ，瘤旁組織；Ｔ即Ｔｕｍｏｒ，腫瘤組織。＊＊／■＜０．０１，，逡逑＊＊＊＊？＜邋０．０００１逡逑１４逡逑

圖２．３．２注：ＨＡＸ－１敲除后導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯：Ａ．流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期：逡逑采用ＣＲ丨ＳＰＲ／Ｃａｓ９技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ中敲除ＨＡＸ－丨基因后，通過(guò)ＰＩ染逡逑色并采用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)ＨＡＸ－１敲除前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果如圖逡逑所示，ＨＡＸ－丨敲除后膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ阻滯于Ｇ０／Ｇ丨期。Ｂ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ蛋白免逡逑疫印跡技術(shù)檢測(cè)ｐ２１蛋白的表達(dá)：采用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ逡逑中敲除ＨＡＸ－１基因后，提�。龋粒兀鼻贸昂蟮模眨保保负停眨福罚停羌�(xì)胞總蛋白，并通過(guò)Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｌｏｔ蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)器中ｐ２１蛋白的表達(dá)情況。以ＧＡＰＤＨ蛋白作為內(nèi)參蛋白，反應(yīng)逡逑總蛋白量。結(jié)果如圖所示，ＨＡＸ－１敲除后，ｐ２１蛋白在Ｕ１１８和Ｕ８７－ＭＧ細(xì)胞中表達(dá)量升高。逡逑＊尸邋＜０．０５，邋＊＊＊＊／■邋＜０．０００１逡逑３１逡逑
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：2591073