【摘要】：Annexin A1(ANXA1)是一類具有抗炎作用的膜聯(lián)蛋白。經(jīng)典研究指出ANXA1主要結(jié)合細(xì)胞膜表面甲酸基肽受體(FPR)發(fā)揮作用,而在細(xì)胞內(nèi)是否有著同樣的抗炎效應(yīng)不得而知。本研究以氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)刺激神經(jīng)元后的上清(NCM)培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,模擬大腦缺血缺氧內(nèi)環(huán)境。探討外源性ANXA1模擬肽(AC2-26)在胞漿內(nèi)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子TNF-α及上游激酶IKKβ的分子機(jī)制。結(jié)果:1.AC2-26下調(diào)NCM刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α分泌及表達(dá):ELISA及RT-PCR檢測(cè)TNFα蛋白分泌及基因表達(dá),結(jié)果顯示:NCM刺激TNFα蛋白分泌及基因表達(dá)增多,AC2-26處理TNF-α蛋白分泌及基因表達(dá)均顯著降低,FPR受體阻斷劑BOC-1對(duì)A2-26介導(dǎo)的TNF-α沒有影響。自噬抑制劑NH_4CL可以翻轉(zhuǎn)AC2-26的作用。Western blot檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNFα蛋白表達(dá),結(jié)果呈示:在NCM和AC2-26刺激下,細(xì)胞內(nèi)TNFα蛋白與對(duì)照組比擬無顯著性差別。共聚焦免疫熒光檢測(cè)AC2-26在小膠質(zhì)細(xì)胞分布,結(jié)果顯示:外源性FITC-AC2-26主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)。2.AC2-26通過自噬降低小膠質(zhì)細(xì)胞IKKβ蛋白活性:Western blot檢測(cè)IKKβ及其下游p-IκB蛋白,結(jié)果顯示:NCM處理小膠質(zhì)細(xì)胞,與對(duì)照組相比,IKKβ及其下游p-IκB蛋白表達(dá)顯著增加。外源性給予AC2-26刺激24小時(shí),可以翻轉(zhuǎn)NCM作用。RT-PCR檢測(cè)IKKβ基因表達(dá),結(jié)果顯示:NCM處理后IKKβ基因表達(dá)增加,而加入AC2-26,與NCM組相比無顯著性差異。在AC2-26基礎(chǔ)上加入NH_4CL預(yù)處理半小時(shí),與AC2-26組相比,IKKβ蛋白表達(dá)增多而mRNA沒有顯著變化。CO-IP檢測(cè)ANXA1與IKKβ結(jié)合,結(jié)果顯示:ANXA1與內(nèi)源性IKKβ沒有相互作用。3.AC2-26促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞HSPB1高表達(dá):Western blot檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞HSPB1表達(dá),結(jié)果顯示:AC2-26單獨(dú)處理或與NCM共刺激小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí),HSPB1蛋白表達(dá)均增加。CO-IP檢測(cè)ANXA1與HSPB1相互作用,結(jié)果顯示:ANXA1可與內(nèi)源性HSPB1結(jié)合。4.HSPB1負(fù)性調(diào)節(jié)IKKβ蛋白表達(dá):CO-IP檢測(cè)HSPB1與IKKβ結(jié)合,結(jié)果顯示:NCM處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞,與對(duì)照組比擬,內(nèi)源性HSPB1與IKKβ結(jié)合增加。預(yù)處理AC2-26,結(jié)合作用進(jìn)一步增強(qiáng)。Western blot檢測(cè)HSPB1與IKKβ相互關(guān)系,結(jié)果顯示:與單獨(dú)轉(zhuǎn)染Flag-IKKβ相比,同時(shí)表達(dá)Flag-IKKβ及GFP-HSPB1,IKKβ蛋白顯著減少。干擾HSPB1 48小時(shí)后IKKβ蛋白表達(dá)增加,相應(yīng)下游TNFα蛋白分泌增加。并且,干擾HSPB1可翻轉(zhuǎn)AC2-26對(duì)IKKβ蛋白的抑制作用。5.AC2-26激活小膠質(zhì)細(xì)胞分子伴侶自噬:Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)記物表達(dá),結(jié)果顯示:AC2-26處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,與對(duì)照組相比,巨自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II及其底物P62沒有顯著變化;分子伴侶自噬標(biāo)記物L(fēng)AMP-2A表達(dá)增加,相應(yīng)底物GADPH顯著減少。與NCM處理組相比,LC3-II沒有變化,LAMP-2A表達(dá)增加。共聚焦免疫熒光檢測(cè)LAMP-2A在溶酶體表達(dá),結(jié)果顯示:AC2-26處理后原代小膠質(zhì)細(xì)胞LAMP-2A與LAMP-1共定位顯著增加。6.ANXA1與HSBP1共同協(xié)助IKKβ轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體:蛋白氨基酸序列分析ANXA1,HSBP1和IKKβ三種蛋白KFERQ序列,結(jié)果顯示:IKKβ、AC2-26及HSPB1蛋白均含有有KFERQ類似肽段。CO-IP檢測(cè)HSC70與三種蛋白結(jié)合,結(jié)果顯示:ANXA1及HSPB1均可與HSC70結(jié)合,IKKβ未檢測(cè)到沉淀。CO-IP檢測(cè)LAMP-2A與三種蛋白結(jié)合,結(jié)果顯示:三種蛋白都可與LAMP-2A結(jié)合;降低HSC70表達(dá),結(jié)合減少。降低ANXA1表達(dá),IKKβ與LAMP-2A結(jié)合減少;降低HSPB1表達(dá),IKKβ與LAMP-2A結(jié)合也減少。7.IKKβ通過分子伴侶的自噬降解:提取大鼠腦組織溶酶體,Western blot檢測(cè)IKKβ、ANXA1及HSPB1蛋白在溶酶體表達(dá),結(jié)果顯示:IKKβ、ANXA1及HSPB1均在溶酶體內(nèi)表達(dá);與對(duì)照組相比,AC2-26處理后溶酶體內(nèi)IKKβ、ANXA1及HSPB1蛋白表達(dá)顯著增加。ELISA及Western blot檢測(cè)分子伴侶的自噬對(duì)IKKβ溶酶體降解作用,結(jié)果顯示:干擾原代小膠質(zhì)細(xì)胞LAMP-2A表達(dá),TNFα蛋白分泌顯著增加,IKKβ蛋白表達(dá)增加;并且干擾LAMP-2A可翻轉(zhuǎn)AC2-26對(duì)IKKβ蛋白的抑制作用。RT-PCR檢測(cè)HSPB1或LAMP-2A對(duì)IKKβ基因表達(dá)影響,結(jié)果顯示:無論在正�；騈CM刺激條件下,干擾小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HSPB1或LAMP-2A,IKKβ的mRNA水平均無變化。結(jié)論:外源性AC2-26與胞漿HSPB1結(jié)合,通過促進(jìn)HSPB1與IKKβ相互作用,并結(jié)合到LAMP-2A,由分子伴侶的自噬降解小膠質(zhì)細(xì)胞IKKβ,從而抑制下游TNFα表達(dá)。
【圖文】：

62圖 1. 自噬的分類及大致步驟結(jié)合，打開折疊結(jié)構(gòu)直接進(jìn)入溶酶體降解。本篇綜述主要探討分子伴侶介導(dǎo)的自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。發(fā)現(xiàn)歷程在二十世紀(jì)八十年代早期,普遍認(rèn)為自噬是一種非選擇性的大量吞噬過程,但有研究觀察到胞漿蛋白在溶酶體中降解速率各不相同[4]。在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中，移除培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分可以加速某些蛋白的降解，而不影響其他蛋白降解速率[5]。于是有

64圖 2. CMA 降解步驟：(a)hsc70 分子伴侶復(fù)合物識(shí)別底物蛋白；(b)底物-分子伴侶復(fù)合物結(jié)合LAMP-2A；(c)底物蛋白打開折疊結(jié)構(gòu)；(d)LAMP-2A 聚合，底物轉(zhuǎn)運(yùn)及降解；(e)LAMP-2A 解聚特異性的模體被分子伴侶識(shí)別發(fā)揮下游作用，然而在某些蛋白質(zhì)中，模體埋藏在蛋白結(jié)構(gòu)中心，，需要分子伴侶協(xié)助打開蛋白折疊；或者模體隱藏在蛋白質(zhì)相互結(jié)合的區(qū)域，底物必須從蛋白復(fù)合物中解離才能被分子伴侶識(shí)別；又或者模體在蛋白質(zhì)與膜結(jié)合的區(qū)域，底物蛋白從亞細(xì)胞膜上釋放才能與分子伴侶結(jié)合。事實(shí)上，CMA 底物蛋白模體與氨基酸電荷屬性有關(guān)，一個(gè)殘缺的包含四個(gè)氨基酸的模體通過翻譯后修飾如磷酸化、乙�；瓤梢詣�(chuàng)造出新的模體結(jié)構(gòu)，改變氨基酸電荷屬性形成 CMA 底物
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 Xiaolei Liu;Sihua Huang;Xingqin Wang;Beisha Tang;Wenming Li;Zixu Mao;;Chaperone-mediated autophagy and neurodegeneration:connections,mechanisms,and therapeutic implications[J];Neuroscience Bulletin;2015年04期

本文編號(hào)：2589891