發(fā)布時間：2020-03-19 07:09

【摘要】：Annexin A1(ANXA1)是一類具有抗炎作用的膜聯(lián)蛋白。經典研究指出ANXA1主要結合細胞膜表面甲酸基肽受體(FPR)發(fā)揮作用,而在細胞內是否有著同樣的抗炎效應不得而知。本研究以氧糖剝奪/復糖復氧(OGD/R)刺激神經元后的上清(NCM)培養(yǎng)小膠質細胞,模擬大腦缺血缺氧內環(huán)境。探討外源性ANXA1模擬肽(AC2-26)在胞漿內抑制小膠質細胞炎癥因子TNF-α及上游激酶IKKβ的分子機制。結果:1.AC2-26下調NCM刺激的小膠質細胞TNF-α分泌及表達:ELISA及RT-PCR檢測TNFα蛋白分泌及基因表達,結果顯示:NCM刺激TNFα蛋白分泌及基因表達增多,AC2-26處理TNF-α蛋白分泌及基因表達均顯著降低,FPR受體阻斷劑BOC-1對A2-26介導的TNF-α沒有影響。自噬抑制劑NH_4CL可以翻轉AC2-26的作用。Western blot檢測小膠質細胞內TNFα蛋白表達,結果呈示:在NCM和AC2-26刺激下,細胞內TNFα蛋白與對照組比擬無顯著性差別。共聚焦免疫熒光檢測AC2-26在小膠質細胞分布,結果顯示:外源性FITC-AC2-26主要分布在小膠質細胞胞漿內。2.AC2-26通過自噬降低小膠質細胞IKKβ蛋白活性:Western blot檢測IKKβ及其下游p-IκB蛋白,結果顯示:NCM處理小膠質細胞,與對照組相比,IKKβ及其下游p-IκB蛋白表達顯著增加。外源性給予AC2-26刺激24小時,可以翻轉NCM作用。RT-PCR檢測IKKβ基因表達,結果顯示:NCM處理后IKKβ基因表達增加,而加入AC2-26,與NCM組相比無顯著性差異。在AC2-26基礎上加入NH_4CL預處理半小時,與AC2-26組相比,IKKβ蛋白表達增多而mRNA沒有顯著變化。CO-IP檢測ANXA1與IKKβ結合,結果顯示:ANXA1與內源性IKKβ沒有相互作用。3.AC2-26促進小膠質細胞HSPB1高表達:Western blot檢測小膠質細胞HSPB1表達,結果顯示:AC2-26單獨處理或與NCM共刺激小膠質細胞24小時,HSPB1蛋白表達均增加。CO-IP檢測ANXA1與HSPB1相互作用,結果顯示:ANXA1可與內源性HSPB1結合。4.HSPB1負性調節(jié)IKKβ蛋白表達:CO-IP檢測HSPB1與IKKβ結合,結果顯示:NCM處理原代小膠質細胞,與對照組比擬,內源性HSPB1與IKKβ結合增加。預處理AC2-26,結合作用進一步增強。Western blot檢測HSPB1與IKKβ相互關系,結果顯示:與單獨轉染Flag-IKKβ相比,同時表達Flag-IKKβ及GFP-HSPB1,IKKβ蛋白顯著減少。干擾HSPB1 48小時后IKKβ蛋白表達增加,相應下游TNFα蛋白分泌增加。并且,干擾HSPB1可翻轉AC2-26對IKKβ蛋白的抑制作用。5.AC2-26激活小膠質細胞分子伴侶自噬:Western blot檢測自噬標記物表達,結果顯示:AC2-26處理原代小膠質細胞24小時后,與對照組相比,巨自噬標記物LC3-II及其底物P62沒有顯著變化;分子伴侶自噬標記物LAMP-2A表達增加,相應底物GADPH顯著減少。與NCM處理組相比,LC3-II沒有變化,LAMP-2A表達增加。共聚焦免疫熒光檢測LAMP-2A在溶酶體表達,結果顯示:AC2-26處理后原代小膠質細胞LAMP-2A與LAMP-1共定位顯著增加。6.ANXA1與HSBP1共同協(xié)助IKKβ轉運至溶酶體:蛋白氨基酸序列分析ANXA1,HSBP1和IKKβ三種蛋白KFERQ序列,結果顯示:IKKβ、AC2-26及HSPB1蛋白均含有有KFERQ類似肽段。CO-IP檢測HSC70與三種蛋白結合,結果顯示:ANXA1及HSPB1均可與HSC70結合,IKKβ未檢測到沉淀。CO-IP檢測LAMP-2A與三種蛋白結合,結果顯示:三種蛋白都可與LAMP-2A結合;降低HSC70表達,結合減少。降低ANXA1表達,IKKβ與LAMP-2A結合減少;降低HSPB1表達,IKKβ與LAMP-2A結合也減少。7.IKKβ通過分子伴侶的自噬降解:提取大鼠腦組織溶酶體,Western blot檢測IKKβ、ANXA1及HSPB1蛋白在溶酶體表達,結果顯示:IKKβ、ANXA1及HSPB1均在溶酶體內表達;與對照組相比,AC2-26處理后溶酶體內IKKβ、ANXA1及HSPB1蛋白表達顯著增加。ELISA及Western blot檢測分子伴侶的自噬對IKKβ溶酶體降解作用,結果顯示:干擾原代小膠質細胞LAMP-2A表達,TNFα蛋白分泌顯著增加,IKKβ蛋白表達增加;并且干擾LAMP-2A可翻轉AC2-26對IKKβ蛋白的抑制作用。RT-PCR檢測HSPB1或LAMP-2A對IKKβ基因表達影響,結果顯示:無論在正�；騈CM刺激條件下,干擾小膠質細胞內HSPB1或LAMP-2A,IKKβ的mRNA水平均無變化。結論:外源性AC2-26與胞漿HSPB1結合,通過促進HSPB1與IKKβ相互作用,并結合到LAMP-2A,由分子伴侶的自噬降解小膠質細胞IKKβ,從而抑制下游TNFα表達。
【圖文】：

62圖 1. 自噬的分類及大致步驟結合，打開折疊結構直接進入溶酶體降解。本篇綜述主要探討分子伴侶介導的自噬在中樞神經系統(tǒng)的作用。發(fā)現(xiàn)歷程在二十世紀八十年代早期,普遍認為自噬是一種非選擇性的大量吞噬過程,但有研究觀察到胞漿蛋白在溶酶體中降解速率各不相同[4]。在培養(yǎng)的成纖維細胞中，移除培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可以加速某些蛋白的降解，而不影響其他蛋白降解速率[5]。于是有

64圖 2. CMA 降解步驟：(a)hsc70 分子伴侶復合物識別底物蛋白；(b)底物-分子伴侶復合物結合LAMP-2A；(c)底物蛋白打開折疊結構；(d)LAMP-2A 聚合，底物轉運及降解；(e)LAMP-2A 解聚特異性的模體被分子伴侶識別發(fā)揮下游作用，然而在某些蛋白質中，模體埋藏在蛋白結構中心，，需要分子伴侶協(xié)助打開蛋白折疊；或者模體隱藏在蛋白質相互結合的區(qū)域，底物必須從蛋白復合物中解離才能被分子伴侶識別；又或者模體在蛋白質與膜結合的區(qū)域，底物蛋白從亞細胞膜上釋放才能與分子伴侶結合。事實上，CMA 底物蛋白模體與氨基酸電荷屬性有關，一個殘缺的包含四個氨基酸的模體通過翻譯后修飾如磷酸化、乙酰化等可以創(chuàng)造出新的模體結構，改變氨基酸電荷屬性形成 CMA 底物
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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1 Xiaolei Liu;Sihua Huang;Xingqin Wang;Beisha Tang;Wenming Li;Zixu Mao;;Chaperone-mediated autophagy and neurodegeneration:connections,mechanisms,and therapeutic implications[J];Neuroscience Bulletin;2015年04期

本文編號：2589891