【摘要】：神經(jīng)元的增殖、分化以及神經(jīng)元遷移到達(dá)皮層正確位置,最終形成大腦皮層高度有序的六層結(jié)構(gòu)。神經(jīng)元的遷移需要細(xì)胞骨架的重塑調(diào)節(jié)以及細(xì)胞間粘附作用,神經(jīng)元遷移異常會引起大腦發(fā)育畸形并可導(dǎo)致各種神經(jīng)性疾病,如:老年性癡呆癥、癲癇、自閉癥等。參與細(xì)胞骨架重塑過程的肌動蛋白纖維(actin filaments,F-actin),能夠維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。而作為肌動蛋白解聚因子家族成員之一的Cotl1(Coactosin-like protein-1),主要與絲切蛋白競爭性結(jié)合肌動蛋白纖維。新的研究表明,絲切蛋白能夠切割肌動蛋白纖維產(chǎn)生新的纖維末端,從而使肌動蛋白纖維可以延伸。因此,絲切蛋白參與維持細(xì)胞骨架的動態(tài)重構(gòu),指導(dǎo)細(xì)胞遷移,對大腦皮層的發(fā)育起著重要作用。但目前對Cotl1在維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定性以及細(xì)胞運(yùn)動方面的研究較少,更沒有關(guān)于Cotl1對大腦發(fā)育過程中神經(jīng)元的遷移的研究。因此,為了探究Cotl1對大腦皮層發(fā)育的影響,本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Cotl1超表達(dá)載體、功能位點(diǎn)突變載體,借助子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染及免疫熒光染色技術(shù)研究了Cotl1在神經(jīng)元的遷移、遷移過程中單個(gè)神經(jīng)元形態(tài)的變化以及細(xì)胞的增殖分化方面的作用。主要結(jié)果如下:1.本實(shí)驗(yàn)成功克隆了Cotl1基因,在mRNA水平檢測到該基因能夠在胚胎小鼠大腦皮層表達(dá);2.成功構(gòu)建了Cotl1超表達(dá)載體:pCAG-Cotl1-myc,運(yùn)用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)研究了該基因?qū)Υ竽X皮層神經(jīng)元遷移的影響。發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育的早期,超表達(dá)Cotl1能以劑量依賴的方式抑制神經(jīng)元的遷移;在胚胎發(fā)育的晚期,超表達(dá)Cotl1神經(jīng)元的頂突起顯著增長,神經(jīng)元的遷移速度受到抑制;3.利用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)和BrdU標(biāo)記技術(shù),研究超表達(dá)Cotl1對神經(jīng)元增殖及分化的影響,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)Cotl1對神經(jīng)元的增殖及最終分化為神經(jīng)元的能力并沒有顯著的變化;4.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Cotl1的功能突變載體pCAG-Cotl1-ABM-myc,結(jié)合子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)研究突變載體對神經(jīng)元遷移的影響,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)Cotl-ABM,神經(jīng)元的遷移及神經(jīng)元的形態(tài)都恢復(fù)到正常狀態(tài),證明該位點(diǎn)即是Cotl1的功能性位點(diǎn)。以上結(jié)果表明,超表達(dá)Cotl1抑制神經(jīng)元的遷移速度但對大腦皮層神經(jīng)元的增殖及分化并沒有顯著影響,73位賴氨酸及75位精氨酸在神經(jīng)元遷移過程中起重要作用。為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供一定的理論依據(jù)。
【圖文】：

Cotl1 主要依靠 75 位賴氨酸與肌動蛋白纖維（actin filaments，F(xiàn)精氨酸的補(bǔ)償結(jié)合作用。因此，Cotl1 對調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定起重新的熱點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)，德國科學(xué)家 de Hostos 和他的同事使用 5-脂氧化酶作為誘餌在盤到 17kDa 的毛狀蛋白（coactosin-like-1, Cotl1），體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)粘性的情況下能夠與肌動蛋白纖維（actin filaments，F(xiàn)-actin）結(jié)合隨后，科學(xué)家在人類，鼠，果蠅以及禽類中都有發(fā)現(xiàn) Cotl1 的表達(dá)在哺乳動物中該蛋白也叫作 CLP（coactosin-like protein）。瑞典與德國科學(xué)家通過 Northern-blot 分析得到，毛狀蛋白廣泛表達(dá)肝臟、胰腺、周邊白細(xì)胞以及骨骼、胸腺中都有所表達(dá) (Provost etrovost 等人還發(fā)現(xiàn)其在心臟中的長度大約為 1.4kb，表明在體內(nèi)存 al. 2001b)。

與肌動蛋白結(jié)合蛋白 Cot 高度一致(de Hostos et al. 1993)。ADF-H 家族分為DF/絲切蛋白（Cofilin），毛狀蛋白（Cotl1），twinfilins（TWFs），膠質(zhì)細(xì)胞突變MFs）以及 drebrin/Abp1，不同家族成員的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能如圖所示（圖 1-2族有單個(gè) ADF-H 區(qū)域，該類包括 ADF，絲切蛋白，毛狀蛋白，解聚蛋白，載等多種蛋白，該種類的 ADF 家族能夠保護(hù)蛋白與肌動蛋白單體的相互作用(Mrubin, 1995; Theriot 1997)。ADF/cofilin 家族的蛋白先后在酵母(Iida et al. 19n et al. 1993)，果蠅(Edwards et al. 1994)，，盤基網(wǎng)柄菌(Aizawa et al. 1995)以及植t al. 1993)中發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)現(xiàn)表明所有的原核細(xì)胞至少能夠表達(dá)該家族的一種蛋 ADF 家族中，毛狀蛋白與 drebrin/Abp1s 具有最高的同源序列，在與肌動蛋白用方面與絲切蛋白的功能相似但不具有絲切蛋白的切割作用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R741

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本文編號：2589807