【摘要】：第一部分 VMAT2基因敲低小鼠帕金森動(dòng)物模型腦組織外泌體分泌特點(diǎn)分析目的:以VMAT2敲低為遺傳背景、MPTP亞急性暴露為誘因的PD模型,通過行為學(xué)、組織病理、和分子生物等方法驗(yàn)證模型的可靠性,并比較比較不同組VMAT2基因敲低小鼠模型腦組織外泌體分泌特點(diǎn)方法:將6月齡的VMAT2敲低50%(HT)的C57小鼠及野生型(WT)C57小鼠隨機(jī)分為MPTP干預(yù)組(MPTP30mg/kg,連續(xù)腹腔注射1周)與未處理組。通過轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)(Rotarod test)及爬桿實(shí)驗(yàn)(Pole test)評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及平衡能力;免疫熒光染色觀察黑質(zhì)致密區(qū)TH 陽性神經(jīng)元、紋狀體TH表達(dá)水平,以及α-syn、psyn(S129)、泛素、P62的異常聚集;Western blot檢測(cè)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)TH、VMAT2等PD相關(guān)分子的表達(dá)。利用超高速離心法分別提取不同處理組小鼠全腦組織外泌體,利用電鏡觀察提取物形態(tài);Western blotting驗(yàn)證提取物是否表達(dá)特異性陽性標(biāo)志物CD63、TSG101及陰性標(biāo)志物calnexin,納米顆粒跟蹤分析儀(Naosight)分析不同處理組小鼠外泌體直徑差別,乙酰膽堿酯酶(AChE)活性測(cè)定外泌體數(shù)目。結(jié)果:相較于對(duì)照組,MPTP干預(yù)后的小鼠爬桿所用時(shí)間 延長(zhǎng),停留在轉(zhuǎn)棒的時(shí)間縮短,并且VMAT2敲低50%(HT)的小鼠運(yùn)動(dòng)功能減退較野生型(WT)小鼠更加明顯。Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示,MPTP暴露能夠?qū)е乱吧图癡MAT2敲低50%(HT)小鼠的黑質(zhì)致密部THp陽性神經(jīng)元數(shù)目減少,紋狀體TH表達(dá)水平減少,其中VMAT2敲低小鼠減少的更明顯,并且,其黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)oα-syn、psyn(S129)、泛素、p62表達(dá)明顯增多。采用超高速離心法提取外泌體,電鏡下觀察呈杯口狀;Western blotting證實(shí)提取物表達(dá)外泌體特異性標(biāo)志物CD63、TSG101,不表達(dá)calnexin;Naosight結(jié)果提示所提物質(zhì)平均直徑為62nm,各組直徑無明顯差異,乙酰膽堿酯酶(AChE)活性測(cè)定結(jié)果提示VMAT2敲低50%聯(lián)合MPTP暴露組小鼠全腦組織外泌體含量明顯增加。結(jié)論:VMAT2敲低50%聯(lián)合MPTP暴露組小鼠是非常好的PD動(dòng)物模型,且其全腦組織外泌體含量明顯增加。第二部分 VMAT2基因敲低小鼠模型腦組織外泌體生成及釋放環(huán)節(jié)分析及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制探討目的:比較各組小鼠腦組織外泌體生成及釋放環(huán)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)差異,及涉及的可能的機(jī)制方法:Western blotting、免疫組化及免疫熒光分析小鼠腦組織外泌體生成及釋放相關(guān)蛋白表達(dá)差異;細(xì)胞免疫熒光及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)觀察蛋白之間的共定位;乙酰膽堿酯酶(AChE)活性測(cè)定外泌體數(shù)目。結(jié)果:Western blotting、免疫組化及免疫熒光結(jié)果提示各組小鼠腦組織外泌體生成相關(guān)蛋白如CD63和TSG101表達(dá)無差異,而釋放相關(guān)蛋白R(shí)ab35在VMAT2敲低50%聯(lián)合MPTP暴露組小鼠表達(dá)明顯增加。細(xì)胞免疫熒光及,Co-IP結(jié)果提示VMAT2與Rab35共定位及存在相互作用。乙酰膽堿酯酶(AChE)活性測(cè)定結(jié)果表明:VMAT2敲低95%(LO)和VMAT2敲低50%(HT)聯(lián)合MPTP暴露組小鼠腦組織外泌體分泌都增多。結(jié)論:極低表達(dá)水平的VMAT2能夠增加腦組織外泌體的分泌,其機(jī)制可能是通過影響Rab35來調(diào)節(jié)外泌體的分泌。第三部分 VMAT2基因敲低小鼠模型腦組組外泌體的致病性研究(細(xì)胞模型)目的:觀察VMAT2基因敲低小鼠模型腦組織外泌體對(duì)細(xì)胞的影響方法:將不同組腦組織來源外泌體加入SH-SY5Y細(xì)胞中,CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力;PKH26標(biāo)記外泌體,加入SH-SY5Y細(xì)胞,分析細(xì)胞對(duì)各組外泌體的吸收情況;Western blotting、免疫熒光比較不同處理組細(xì)胞α-syn、psyn(S129)、α-syn纖維體、P62、泛素等表達(dá)差異;結(jié)果:SH-SY5Y可以吸收外泌體,各組吸收無明顯差異;Western blotting、免疫熒光結(jié)果提示:VMAT2敲低50%聯(lián)合M PTP暴露組小鼠腦組織外泌體加入細(xì)胞后,會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞α-syn、psyn(S129)、α-syn纖維體、P62、泛素等表達(dá)升高結(jié)論:在MPTP干預(yù)下,VMAT2敲低50%(HT)小鼠腦組織外泌體可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞PD樣損傷。第四部分:VMAT2基因敲低小鼠模型腦組織外泌體的致病性研究(動(dòng)物模型)目的:觀察紋狀體立體定向注射VMAT2基因敲低小鼠模型腦組織外泌體后對(duì)小鼠的致病作用方法:通過立體定向,在野生型C57小鼠紋狀體區(qū)置管,間斷性注射不同組小鼠腦組織來源外泌體3月;阿樸嗎啡皮下注射觀察是否有旋轉(zhuǎn)行為,Rotarod及爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及平衡能力;Western blotting、免疫熒光、免疫組化觀察中腦及紋狀體TH、α-syn、泛素(ubiqutin)、psyn(S129)、p62、IBA1等表達(dá)水平。RT-qPCR測(cè)定TNFα、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)水平。結(jié)果:接受VMAT2敲低50%聯(lián)合MPTP暴露組腦組織來源外泌體干預(yù)的小鼠,阿樸嗎啡可誘導(dǎo)出現(xiàn)偏側(cè)旋轉(zhuǎn)行為;Rotarod及爬桿實(shí)驗(yàn)顯示小鼠運(yùn)動(dòng)能力受損,Western blotting、免疫熒光、免疫組化結(jié)果提示TH表達(dá)減少、而α-syn、psyn(S129)、p62、泛素、IBA1則表達(dá)升高。TNFα、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)水平升高。結(jié)論:立體定向注射VMAT2敲低50%聯(lián)合MPTP暴露組腦組織來源外泌體能夠誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)PD樣改變。第五部分:VMAT2基因敲低小鼠模型腦組織來源外泌體致病性的可能機(jī)制的研究目的:探究VMAT2基因敲低小鼠模型腦組織來源外泌體致病性的可能機(jī)制方法:Western blotting觀察各組外泌體α-syn、iNOS、TNFa、IL-6、GFAP、NeuN、IBA1 的含量;Western blotting觀察DNAαse、RNAase、Proteinase K、高溫分別處理外泌體后對(duì)其致病性的影響;通過ELISA比較不同組小鼠腦組織來源外泌體對(duì)BV2細(xì)胞促炎癥因子分泌的影響;Western blotting觀察不同組外泌體加入BV2細(xì)胞后對(duì)NFκB通路的影響;Western blotting觀察外泌體與TNFa中和抗體孵育后對(duì)BV2細(xì)胞NFκB通路的影響。結(jié)果:Western blotting結(jié)果提示:VMAT2敲低50%(HT)聯(lián)合MPTP暴露的小鼠腦組織來源外泌體α-syn寡聚體、iNSO、IL6、TNF-α、IBA1含量相較于其他組明顯增多,而NeuN、GFAP相較于其他組則減少;經(jīng)Proteinase K、高溫分別處理的外泌體加入細(xì)胞后,SH-SY5Y細(xì)胞oα-syn表達(dá)水平相對(duì)DNAase、RNAase處理組明顯減少,說明外泌體的致病性與其攜帶的蛋白密切相關(guān),而與核酸關(guān)系不大;ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)VMAT2敲低50%(HT)聯(lián)合MPTP暴露組小鼠腦組織來源外泌體可以顯著增加BV2細(xì)胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;Western blotting結(jié)果提示:VMAT2敲低50%(HT)聯(lián)合MPTP暴露組小鼠腦組織來源外泌體可以激活BV2細(xì)胞N FκB通路,并且是TN Fα依賴的。結(jié)論:VMAT2敲低50%(HT)聯(lián)合MPTP暴露組小鼠腦組織外泌體的致病性主要與其攜帶的蛋白有關(guān),涉及的機(jī)制包括傳播致病性α-syn,激活小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥,NFκB通路參與其中。
【圖文】：

384、 同處理 小鼠 質(zhì) p-syn (s129) 表達(dá)的變化帕金森 ， 型的 я α-syn 的增 ，還 蛋白的 型的 磷酸化 ， К絲氨酸 129 位點(diǎn) 磷酸化 為 見。 實(shí)驗(yàn)ж α-syn 磷酸化 ，結(jié)果 ：VMAT2 低 50% 在 MPTP ， psyn (S129) 增加、 （ 1-5）

395、 同處理 小鼠 質(zhì) P62 表達(dá)的變化。 實(shí)驗(yàn)研究жж p62 ，，結(jié)果 ：VMAT2 低 50% 在 MPTP 亞 ， p62 增加、 型 在 MPTP p62 я 增加、 （ 1-6）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.5

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