發(fā)布時(shí)間：2020-03-18 01:20

【摘要】：目的:1、比較mi RNA-210在急性腦梗死(ACI)患者及健康人群血清中的表達(dá)差異;2、評(píng)估血清中mi RNA-210表達(dá)水平在ACI患者的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用以及與患者血清中炎癥因子水平的相關(guān)性;3、探討ACI患者血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)mi RNA-210表達(dá)的影響;4、研究mi RNA-210對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖與凋亡的影響;5、研究mi RNA-210對(duì)HUVECs細(xì)胞中Hes1、Notch1、VEGF在m RNA和蛋白水平表達(dá)的調(diào)控;6,建立大鼠大腦中腦動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型,研究mi RNA-210在MCAO模型大鼠血清和腦組織中的表達(dá)水平及其相關(guān)性;7、檢測(cè)MCAO大鼠模型血清和腦組織中Hes1、Notch1、VEGF在m RNA水平的表達(dá),以及腦組織中Hes1、Notch1、VEGF在蛋白水平表達(dá)情況,研究mi RNA-210表達(dá)對(duì)大鼠急性腦梗死的調(diào)控機(jī)制。方法:1,選取2016年1月至2016年12月泰州市人民醫(yī)院急診科接診的ACI患者70例,同時(shí)納入40例正常體檢者作為健康對(duì)照組。采用熒光實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-q PCR)法檢測(cè)ACI患者和健康對(duì)照組血清中mi RNA-210表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。建立受試者工作曲線(ROC)評(píng)估血清mi RNA-210表達(dá)水平對(duì)ACI的診斷價(jià)值。2、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法分別檢測(cè)血清炎癥因子C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)及降鈣素原(PCT)水平。計(jì)算患者入院后美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分。研究患者血清中mi RNA-210表達(dá)與炎癥因子水平及NIHSS評(píng)分的相關(guān)性。3、ACI患者發(fā)病后第30天參照格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(GOS)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)后分析,系統(tǒng)評(píng)價(jià)mi RNA-210以及炎癥因子在評(píng)估ACI疾病預(yù)后中的價(jià)值。4、收集ACI患者及健康人血清,通過(guò)RT-q PCR法檢測(cè)比較患者血清培養(yǎng)組、健康人血清培養(yǎng)組和空白對(duì)照組三組HUVECs細(xì)胞中mi RNA-210含量,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。5、應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和Annexin V-PI雙染法及流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染mi RNA-210模擬物組(mi RNA-210組)、轉(zhuǎn)染模擬物陰性對(duì)照組(NC組)和未轉(zhuǎn)染組(Control組)三組HUVECs細(xì)胞增殖和凋亡情況,評(píng)價(jià)mi RNA-210對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖和凋亡的影響。6、通過(guò)RT-q PCR、Western blot方法檢測(cè)mi RNA-210組、NC組和Control組HUVECs中Hes1,Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。7、選取健康SD大鼠22只,隨機(jī)分為MCAO模型組12只和正常對(duì)照組10只,采取線栓法構(gòu)建大鼠MCAO模型并進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)分。其中1只MCAO大鼠行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察腦組織梗死情況,取另1只MCAO大鼠進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色,顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化情況。8、采用RT-q PCR法分別檢測(cè)MCAO模型大鼠和正常對(duì)照組大鼠各10只血清和腦組織中mi RNA-210表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。9、應(yīng)用RT-q PCR和Western blot法檢測(cè)MCAO模型大鼠和正常對(duì)照組大鼠血清中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA水平的表達(dá)和腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA及蛋白水平的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1,ACI患者血清中mi RNA-210水平與健康對(duì)照組相比明顯上調(diào)(P0.05)。ROC曲線分析結(jié)果顯示,mi RNA-210的曲線下面積(AUC)為0.942,95%置信區(qū)間(CI)為0.898~0.986,最優(yōu)割點(diǎn)為1.6,而切點(diǎn)的敏感性和特異性分別為82.86%和97.50%。2,ACI患者血清中mi RNA-210水平與GOS預(yù)后評(píng)分成正相關(guān),和NIHSS評(píng)分成負(fù)相關(guān);與健康對(duì)照組相比,ACI患者血清CRP、IL6及NGAL水平升高(P0.05),但與GOS預(yù)后評(píng)分和NIHSS評(píng)分無(wú)相關(guān)性。3,ACI患者血清培養(yǎng)HUVECs后,與健康人血清培養(yǎng)組和空白對(duì)照組相比,HUVECs中mi RNA-210表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01)。4,CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,mi RNA-210組較NC組和Control組,培養(yǎng)48h后HUVECs的細(xì)胞增殖率上升(P0.05),培養(yǎng)72h后HUVECs的細(xì)胞增殖率顯著上升(P0.01)。培養(yǎng)48h后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-PI雙染,流式細(xì)胞儀分析顯示:mi RNA-210組較NC組及Control組,HUVECs細(xì)胞凋亡率顯著下降(P0.01)。5,應(yīng)用RT-q PCR、Western blot方法檢測(cè)mi RNA-210組HUVECs細(xì)胞中Hes1,Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平表達(dá)結(jié)果顯示:mi RNA-210組中Hes1和VEGF在m RNA水平表達(dá)增加,與另外兩組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),而Notch1表達(dá)與另外兩組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);Hes1,Notch1和VEGF蛋白水平表達(dá)mi RNA-210組與其余兩組比較均顯著上調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。6,TTC染色后可見(jiàn)MCAO大鼠模型中腦組織梗死側(cè)中明顯梗死病灶。HE染色后顯微鏡下可見(jiàn)MCAO模型梗死病灶組織中大量神經(jīng)細(xì)胞核濃縮凋亡,而健側(cè)腦組織見(jiàn)少許凋亡細(xì)胞。7,應(yīng)用RT-q PCR法檢測(cè)MCAO大鼠模型血清和腦組織中mi RNA-210表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCAO模型大鼠腦組織及血清組織中mi RNA-210表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯上調(diào),且血清和腦組織中mi RNA-210的表達(dá)具有相關(guān)性,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8,應(yīng)用RT-q PCR、Western blot方法檢測(cè)MCAO大鼠模型血清和腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCAO大鼠模型血清及腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在m RNA水平較正常對(duì)照組大鼠均上調(diào);腦組織中Hes1、Notch1和VEGF在蛋白水平較正常對(duì)照組大鼠亦上調(diào)。均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1,在ACI患者中,血清mi RNA-210有潛力成為ACI診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物;炎癥因子CRP、IL-6、NGAL水平在ACI早期升高,但與ACI患者神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度和預(yù)后不相關(guān)。2,ACI患者血清環(huán)境能夠提高HUVECs細(xì)胞中mi RNA-210的表達(dá);通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):mi RNA-210在ACI中的調(diào)控機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡以及上調(diào)Hes1、VEGF在m RNA表達(dá)和上調(diào)Hes1、Notch1和VEGF在蛋白水平的表達(dá)相關(guān);3,成功構(gòu)建大鼠MCAO模型,MCAO大鼠血清和腦組織中mi RNA-210的表達(dá)水平均升高,在動(dòng)物模型中再次驗(yàn)證mi RNA-210可能通過(guò)上調(diào)Hes1、Notch1和VEGF在m RNA和蛋白水平的表達(dá),從而參與ACI的調(diào)控機(jī)制。
【圖文】：

給予碘伏消毒后，取頸部正中切口，逐層切開(kāi)用彎頭止血鉗鈍性分離周?chē)M織及腺體，充分分離，觸及動(dòng)脈搏動(dòng)后，逐步分離右側(cè)頸動(dòng)脈分離，辨別頸動(dòng)脈鞘內(nèi)右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)脈(ICA)等解剖結(jié)構(gòu)。小心剝開(kāi)并輕輕提起頸。同樣分離剝開(kāi)并用細(xì)線將右側(cè)頸總動(dòng)脈提起動(dòng)脈夾將頸總動(dòng)脈阻斷后，將右側(cè)頸總動(dòng)脈在夾。在頸外動(dòng)脈壁剪一斜角切口，插入準(zhǔn)備好外動(dòng)脈經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，線當(dāng)回縮后調(diào)整角度再行插入，線栓插入深度大栓栓塞完成后，一起結(jié)扎右側(cè)頸外動(dòng)脈和線栓進(jìn)一步清創(chuàng)，縫合切口。待大鼠清醒。術(shù)畢

-210 在急性腦梗死中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究 期的 HUVECs 細(xì)胞，，提取各組總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后， HUVECs 細(xì)胞中的 miRNA-210 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示UVECs 細(xì)胞中 miRNA-210 表達(dá)水平顯著增高，與健康人血清比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見(jiàn)圖 10�？梢�(jiàn)急性腦梗死患iRNA-210 的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：2587989