【摘要】：脊髓性肌肉萎縮(Spinal muscular atrophy, SMA)是指一類由于脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Anterior horn cells of the spinal cord)缺失而導(dǎo)致的進(jìn)行性骨骼肌無力和萎縮的一組神經(jīng)變性疾病。該疾病主要是由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活(Survival motor neuron1, SMN1)基因缺失或突變造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白的缺失或功能喪失所致。目前臨床上尚無有效的治療方法。人的SMN1基因在每條5號染色體長臂1區(qū)3帶,SMN2與SMN1高度同源,二者在外顯子上僅存在兩個(gè)堿基的差別。SMN2存在于所有的SMA病人中。本研究聯(lián)合利用類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALEN)技術(shù)對病人特異性的誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的SMN2基因進(jìn)行定點(diǎn)打靶,使SMN2基因定點(diǎn)誘變成類SMN1基因,表達(dá)出完整的SMN蛋白,行使其功能,從而實(shí)現(xiàn)對SMA的自體化基因治療。 一、SMA病人特異性iPSCs的誘導(dǎo) 目的：利用SMA病人來源的尿液細(xì)胞誘導(dǎo)SMA病人特異性的iPS細(xì)胞 方法：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四種轉(zhuǎn)錄因子Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4導(dǎo)入SMA患者來源的尿液細(xì)胞中,在VPA的作用下,獲得SMA病人特異性的iPSCs。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、核型分析、堿性磷酸酶染色、干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測及體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：(1)免疫熒光檢測顯示誘導(dǎo)產(chǎn)生的SMA-iPSCs干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況與正常ESCs一致,堿性磷酸酶染色呈陽性；(2)對誘導(dǎo)后傳至P15代的SMA-iPSCs行核型檢測顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞沒有發(fā)生染色體水平的突變,檢測結(jié)果同該病人外周血檢測結(jié)果一致。 結(jié)論：本研究成功將SMA病人來源的尿液細(xì)胞誘導(dǎo)為病人特異性的iPSCs,初步鑒定結(jié)果顯示該病人特異性的iPSCs具有干細(xì)胞特性。 二、SMA非病毒基因治療載體的構(gòu)建與打靶 目的：構(gòu)建定點(diǎn)誘變載體pMN-Neo,該載體定點(diǎn)靶向SMN2基因,聯(lián)合TALEN技術(shù)將pMN-Neo定點(diǎn)靶入SMA-iPSCs的SMN2基因7、8號外顯子區(qū),篩選獲得表達(dá)SMN蛋白的克隆。 方法：1.通過PCR擴(kuò)增,酶切,連接等分子技術(shù)構(gòu)建載體pMN,再在載體pMN中加入Neo篩選基因的完整表達(dá)框獲得載體pMN-Neo;2.采用單細(xì)胞核轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染單細(xì)胞化的SMA-iPSCs。 結(jié)果：1.通過Nhe Ⅰ酶切,測序等方法鑒定,顯示所構(gòu)建的打靶載體pMN-Neo與預(yù)期理論一致；2.pMN-Neo核轉(zhuǎn)SMA-iPSCs中,經(jīng)G418篩選13天獲得122個(gè)克隆。 結(jié)論：成功構(gòu)建TALEN和定點(diǎn)誘變載體pMN-Neo,初步獲得待鑒定SMA病人特異性的iPS打靶細(xì)胞系。
【圖文】：

Intron 7圖2: SMNl與SMN2外顯子上兩個(gè)堿基區(qū)別的位置由于7號外顯子第6個(gè)堿基的改變，使SMN2產(chǎn)生了選擇性剪切，SMN丨能表達(dá)產(chǎn)生100%有活性的SMN蛋白，而經(jīng)過選擇性剪切的SMN2有85?90%的SMN蛋白因缺少7號外顯子而失去活性[6]。（如圖3所示）1

Stable protein圖1:人SMNl與SMN2基因在5ql3區(qū)基因的排列與表達(dá)模式圖SMN蛋白大小為38kDa，所有的細(xì)胞中均有表達(dá)，廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中。SMN蛋白在胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。SMN蛋白的完全缺乏對于胚胎是致死的，在胚胎發(fā)育期間，SMN蛋白在各組織內(nèi)高表達(dá)，并達(dá)到峰值，而在胚胎發(fā)育后期以及出生之后，在除神經(jīng)細(xì)胞外的其他細(xì)胞中，SMN表達(dá)量均降至極低水平。在高級哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞中，，S_缺乏或表達(dá)量過低會(huì)影響神經(jīng)肌肉接頭（neuron muscular junction, NMJ)形成，以及其形成之后的正常維持，而這將導(dǎo)致骨豁肌發(fā)育受阻。與此同時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)在SMA模型小鼠中
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R746.4

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Menghua Wu;Guilai Chen;Baoyang Hu;;Induced Pluripotency for Translational Research[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

2 Juan Wang;Qi Gu;Jie Hao;Donghui Bai;Lei Liu;Xiaoyang Zhao;Zhonghua Liu;Liu Wang;Qi Zhou;;Generation of Induced Pluripotent Stem Cells with High Efciency from Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

3 Minjie Zhang;Caiyun Yang;Huixian Liu;Yingli Sun;;Induced Pluripotent Stem Cells Are Sensitive to DNA Damage[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

4 李苗苗;步佳佳;張秀梅;劉勝輝;李運(yùn)合;陸新華;吳青松;孫偉生;孫光明;;不同產(chǎn)區(qū)冬夏季節(jié)菠蘿果實(shí)維生素的差異性研究[J];果樹學(xué)報(bào);2013年05期

5 王堯;王雷;陸玉華;范向軍;朱銘巖;朱沙俊;王志偉;;小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞和胚胎成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的效率比較[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年12期

6 徐萍;王s

本文編號：2582273