【摘要】：脊髓性肌肉萎縮(Spinal muscular atrophy, SMA)是指一類由于脊髓前角運動神經元(Anterior horn cells of the spinal cord)缺失而導致的進行性骨骼肌無力和萎縮的一組神經變性疾病。該疾病主要是由于運動神經元存活(Survival motor neuron1, SMN1)基因缺失或突變造成運動神經元蛋白的缺失或功能喪失所致。目前臨床上尚無有效的治療方法。人的SMN1基因在每條5號染色體長臂1區(qū)3帶,SMN2與SMN1高度同源,二者在外顯子上僅存在兩個堿基的差別。SMN2存在于所有的SMA病人中。本研究聯(lián)合利用類轉錄激活效應因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALEN)技術對病人特異性的誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的SMN2基因進行定點打靶,使SMN2基因定點誘變成類SMN1基因,表達出完整的SMN蛋白,行使其功能,從而實現(xiàn)對SMA的自體化基因治療。 一、SMA病人特異性iPSCs的誘導 目的：利用SMA病人來源的尿液細胞誘導SMA病人特異性的iPS細胞 方法：利用逆轉錄病毒將四種轉錄因子Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4導入SMA患者來源的尿液細胞中,在VPA的作用下,獲得SMA病人特異性的iPSCs。通過細胞形態(tài)學、核型分析、堿性磷酸酶染色、干細胞表面標志物檢測及體內分化實驗對其進行鑒定。 結果：(1)免疫熒光檢測顯示誘導產生的SMA-iPSCs干細胞表面標志物表達情況與正常ESCs一致,堿性磷酸酶染色呈陽性；(2)對誘導后傳至P15代的SMA-iPSCs行核型檢測顯示誘導后細胞沒有發(fā)生染色體水平的突變,檢測結果同該病人外周血檢測結果一致。 結論：本研究成功將SMA病人來源的尿液細胞誘導為病人特異性的iPSCs,初步鑒定結果顯示該病人特異性的iPSCs具有干細胞特性。 二、SMA非病毒基因治療載體的構建與打靶 目的：構建定點誘變載體pMN-Neo,該載體定點靶向SMN2基因,聯(lián)合TALEN技術將pMN-Neo定點靶入SMA-iPSCs的SMN2基因7、8號外顯子區(qū),篩選獲得表達SMN蛋白的克隆。 方法：1.通過PCR擴增,酶切,連接等分子技術構建載體pMN,再在載體pMN中加入Neo篩選基因的完整表達框獲得載體pMN-Neo;2.采用單細胞核轉染的方式轉染單細胞化的SMA-iPSCs。 結果：1.通過Nhe Ⅰ酶切,測序等方法鑒定,顯示所構建的打靶載體pMN-Neo與預期理論一致；2.pMN-Neo核轉SMA-iPSCs中,經G418篩選13天獲得122個克隆。 結論：成功構建TALEN和定點誘變載體pMN-Neo,初步獲得待鑒定SMA病人特異性的iPS打靶細胞系。
【圖文】：

Intron 7圖2: SMNl與SMN2外顯子上兩個堿基區(qū)別的位置由于7號外顯子第6個堿基的改變，使SMN2產生了選擇性剪切，SMN丨能表達產生100%有活性的SMN蛋白，而經過選擇性剪切的SMN2有85?90%的SMN蛋白因缺少7號外顯子而失去活性[6]。（如圖3所示）1

Stable protein圖1:人SMNl與SMN2基因在5ql3區(qū)基因的排列與表達模式圖SMN蛋白大小為38kDa，所有的細胞中均有表達，廣泛分布于細胞質，細胞核中。SMN蛋白在胚胎發(fā)育過程中具有重要的作用。SMN蛋白的完全缺乏對于胚胎是致死的，在胚胎發(fā)育期間，SMN蛋白在各組織內高表達，并達到峰值，而在胚胎發(fā)育后期以及出生之后，在除神經細胞外的其他細胞中，SMN表達量均降至極低水平。在高級哺乳動物神經細胞中，，S_缺乏或表達量過低會影響神經肌肉接頭（neuron muscular junction, NMJ)形成，以及其形成之后的正常維持，而這將導致骨豁肌發(fā)育受阻。與此同時，研究人員發(fā)現(xiàn)在SMA模型小鼠中
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R746.4

【共引文獻】

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6 徐萍;王s

本文編號：2582273