【摘要】：發(fā)作性運(yùn)動(dòng)源性舞蹈手足徐動(dòng)癥(PKC, OMIM 128200)又被稱作發(fā)作性運(yùn)動(dòng)源性肌張力障礙,最早在1976年被發(fā)現(xiàn),是最常見(jiàn)的陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙疾病。其臨床表現(xiàn)主要為突發(fā)的不自主運(yùn)動(dòng),主要包括肌張力障礙姿勢(shì)、舞蹈病以及手足徐動(dòng)等,一般由靜態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\(yùn)動(dòng)狀態(tài)或者改變運(yùn)動(dòng)速度誘發(fā)。本課題組與國(guó)內(nèi)外的其他研究學(xué)者同時(shí)于2011年發(fā)現(xiàn)位于16p11.2編碼富含脯氨酸的二次跨膜蛋白PRRT2的基因雜合突變會(huì)導(dǎo)致PKC發(fā)生,因而PRRT2基因被認(rèn)為是PKC的致病基因。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在PRRT2的N端有一段富含脯氨酸的序列和一個(gè)糖基化位點(diǎn),而在C端有兩個(gè)在物種間高度保守跨膜結(jié)構(gòu)域。在小鼠研究中發(fā)現(xiàn),Prrt2主要表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中,并且在大腦皮層、海馬以及小腦的表達(dá)量最高。目前對(duì)PRRT2的功能尚不清楚,Lee等通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PRRT2與SNAP25之間的相互作用,并且發(fā)現(xiàn)在病人中出現(xiàn)頻率最高的PRRT2 p.R217Pfs*8截短突變體喪失表達(dá)。SNAP25是t-SNARE家族的成員,參與形成神經(jīng)細(xì)胞外泌的膜融合裝置,也在興奮性氨基酸遞質(zhì)的釋放中發(fā)揮重要作用。而興奮性氨基酸遞質(zhì)尤其是谷氨酸的釋放失調(diào)在癲癇、偏頭疼以及自閉癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著關(guān)鍵作用。另一方面,在2012年一項(xiàng)高分辨率蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了21種新的參與形成非變性a-氨基-3-羥基-5-甲基1-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體的蛋白,其中就包括PRRT2,并且發(fā)現(xiàn)PRRT2與內(nèi)部核心亞基GRIA1之間聯(lián)系緊密。為了研究PRRT2的蛋白功能,本研究首先用高效液相色譜分析方法檢測(cè)了7例PKC病人以及12例正常對(duì)照受試者血清中三種興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。結(jié)果表明PKC病人血清中天冬氨酸和谷氨酸的含量明顯高于正常對(duì)照受試者。隨后,用可以敲除Prrt2表達(dá)的shRNA慢病毒感染原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元進(jìn)行功能缺失實(shí)驗(yàn)。用高效液相色譜分析檢測(cè)培養(yǎng)基中興奮性氨基酸的含量,發(fā)現(xiàn)干擾組培養(yǎng)基中谷氨酸的含量明顯高于對(duì)照組。結(jié)果顯示PRRT2可能在調(diào)節(jié)谷氨酸的釋放中發(fā)揮抑制作用。更重要的是多重染色免疫熒光結(jié)果顯示Prrt2定位在谷氨酸能突觸上,這與它的功能相一致。為了進(jìn)一步研究PRRT2 與 SNAP25之間的相互作用,構(gòu)建了PRRT2 WT, p.R217Pfs*8以及p.A287T過(guò)表達(dá)載體,其中p.A287T是本課題組發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變體。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p.A287T錯(cuò)義突變PRRT2與SNAP25之間的相互作用減弱,提示突變的PRRT2可能通過(guò)調(diào)節(jié)與SNAP25之間的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)谷氨酸的釋放。為了進(jìn)一步尋找與PRRT2存在相互作用的蛋白,通過(guò)體內(nèi)以及體外免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PRRT2與GRIA1之間的相互作用,而且與野生型PRRT2相比,PRRT2突變體與GRIA1之間的相互作用減弱。更為有意義的是通過(guò)體外活細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRRT2突變體可以使GRIA1在細(xì)胞膜表面的分布增加,而這可能會(huì)影響AMPA受體的功能�？傊�,本研究發(fā)現(xiàn),在PKC病人血清中以及敲除Prrt2表達(dá)的神經(jīng)元培養(yǎng)基中谷氨酸的含量明顯升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變的PRRT2與SNAP25之間的相互作用減弱,提示了PRRT2發(fā)揮功能的方式。最后,本研究首次證實(shí)了PRRT2與GRIA1之間的相互作用,而PRRT2突變體會(huì)干擾這種相互作用并且使GRIA1在細(xì)胞膜表面的分布增加。本研究表明,PRRT2突變體導(dǎo)致谷氨酸信號(hào)通路異常。
【圖文】：

ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２邋（ｓｈＲＮＡ－１）。通過(guò)邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣ艮檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)邋ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２邋序列可將逡逑仍化２基因的ｍＲＮＡ表達(dá)水平干擾掉８０％左右，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在蛋白水逡逑平上也表現(xiàn)出良好的干擾效果（圖７Ａ和Ｂ）并且包裝成慢病毒后具有感染活性（圖逡逑７Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑�。保策妳㈠义希�。８邋W邋／邋／逡逑教■邐／／／逡逑占邋０．２，邐■占逡逑至邋0１邐１—Ｍ－邋一邋Ｈｇｉｎ邋ＧＡ陽(yáng)Ｈ逡逑／邋／逡逑■國(guó)逡逑圖７．篩選有效的ｓｈＲＮＡ序列并包裝成慢病毒逡逑用ｐＬＵ．７空質(zhì)�；蛘咧亟MＷ后的ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２質(zhì)粒與過(guò)表達(dá)質(zhì)粒Ｍｙｃ－Ｐｒｒｔ２同時(shí)轉(zhuǎn)逡逑染ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞，（Ａ）４８ｈ后提取細(xì)胞總ｍＲＮＡ，，通過(guò)Ｒｅａｌｔｉｍｅ－ＰＣ民檢測(cè)轉(zhuǎn)入逡逑ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２質(zhì)粒的干擾組與轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照組之間Ａｒｃ基因ｍＲＮＡ相對(duì)表達(dá)逡逑水平的差異，ＧＡＰＤＨ為內(nèi)參基因（統(tǒng)計(jì)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，ｎ邋＝邋３）；邋（Ｂ）逡逑４８邋ｈ后提取細(xì)胞總蛋白，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測(cè)轉(zhuǎn)入ｓｈＲＮＡ－Ｐｒｒｔ２質(zhì)粒的干擾組與轉(zhuǎn)逡逑５８逡逑

被感染的ＨＥＫ２９３Ｔ細(xì)胞在激發(fā)光下會(huì)發(fā)出綠色巧光，標(biāo)尺為１００邋＾ｍｉ。＊＊，Ｐ＜邋０．０１。逡逑接下來(lái)培養(yǎng)Ｅ１８．５胎鼠的大腦皮層神經(jīng)元，并用ａｎｔｉ－ＭＡＰ２抗體進(jìn)斤免疫巧光逡逑實(shí)驗(yàn)，鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞確實(shí)是神經(jīng)元細(xì)胞，如圖８所示，綠色巧光顯示被ＭＡＰ２逡逑抗體標(biāo)記的神經(jīng)元樹(shù)突。逡逑ＭＡＰ２邐ＤＡＰＩ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑圖８．鑒定原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元逡逑培養(yǎng)到第８天的神經(jīng)元進(jìn)行免疫巧光us示被ａｎｔｉ－ＭＡＰ２抗體標(biāo)記的神經(jīng)元樹(shù)突，逡逑ＭＡＰ２—抗１：２００稀釋，標(biāo)尺為５０邋［ｊｍ。逡逑３．２邋Ｐｒｒｔ２表達(dá)被敲低后小鼠神經(jīng)元培養(yǎng)基中谷氨酸含量X椂噱義纖淙荒約掛漢脫褐溆醒鄖燒�，覛gǔ潭壬獻(xiàn)璋舜蟛糠治鎦實(shí)淖雜閃麇義隙�，但矢`緹陀醒芯糠⑾幟約掛褐泄勸彼岬吶ǘ群脫褐泄勸彼岬吶ǘ卻嬖謖喙劐義嫌紗送撇猓校耍貌∪搜逯衆(zhòng)鏊降男朔芐月然崢贍芊從沉似淠約掛褐行朔苠義閑園被岷懇財(cái)擼鈧盞賈鋁舜竽緣敝猩窬男朔芐怨摺Ｎ搜櫓ふ飧黽馘義仙�，分柄嵜对照慢病陡�(jìng)停螅瑁遙危粒校潁潁簦倉(cāng)刈槁《靖腥酒げ閔窬緩笫占嘌義匣锨�，用高效液相色谱分吸w觳馀嘌腥職被岬暮俊Ｍ碧崛「腥競(jìng)笊皴義暇淖艿鞍準(zhǔn)觳猓螅瑁遙危諒《靖扇牛校潁潁簦駁鞍妝澩锏男

本文編號(hào)：2581953