【摘要】：研究背景 隨著干細(xì)胞移植技術(shù)的逐漸成熟，細(xì)胞治療在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用引起廣泛關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是現(xiàn)如今應(yīng)用較多的一類具有多向分化能力的成體干細(xì)胞，近年研究顯示：從人羊膜中提取而來(lái)的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（Amniotic mesenchymal stem cells，AMSCs），由于其相對(duì)于胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來(lái)源廣泛、取材方便、易擴(kuò)增、多向分化潛能以及免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又避開(kāi)了胚胎干細(xì)胞來(lái)源缺乏、倫理道德和法律限制等問(wèn)題，是目前細(xì)胞治療的一種理想的種子細(xì)胞來(lái)源。越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，移植羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可以改善神經(jīng)功能缺損癥狀，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。 小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia MI）是目前公認(rèn)的對(duì)腦部損傷、炎性以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)行反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，其主要特征是容易被任何形式的腦損傷或疾病所激活，在多種神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮著損傷和修復(fù)的雙重作用�；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮著包括吞噬、免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒性和通過(guò)抗原提呈T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)等作用。MI被激活后釋放的多種細(xì)胞因子可引起不同程度的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，構(gòu)成了“病理級(jí)聯(lián)”效應(yīng)。由此我們推測(cè)，在CNS早期的炎癥或損傷過(guò)程中如果能調(diào)控MI的活化程度將對(duì)控制整個(gè)病理或損傷過(guò)程非常有利。 CD200屬于白細(xì)胞分化抗原,是一種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白,其表達(dá)范圍較廣，主要在神經(jīng)細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、B細(xì)胞T細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。有研究表明CD200可以表達(dá)在羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表面。CD200R與其配體CD200均屬于免疫球蛋白超家族，CD200R主要表達(dá)在包括小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和少量的T細(xì)胞上。CD200與CD200R通過(guò)細(xì)胞間接觸,誘導(dǎo)免疫耐受,傳遞抑制性信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn),CD200能夠下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài),使小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子減少。由此我們?cè)O(shè)想羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞也有可能通過(guò)這種途徑來(lái)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)MI的活化，進(jìn)而控制由其觸發(fā)的一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，從而發(fā)揮細(xì)胞治療作用。 目的 本實(shí)驗(yàn)研究CD200-CD200R相關(guān)的細(xì)胞間接觸途徑,探索CD200在羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中的作用，以期更全面了解羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的作用機(jī)制。 第一部分羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 方法 1.AMSCs的體外培養(yǎng)及鑒定，分別觀察其原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況并作出生長(zhǎng)曲線；AMSCs的體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) 2.MI的體外培養(yǎng)、純化及鑒定 3.MI的活化 結(jié)果 1.成功由羊膜組織分離、培養(yǎng)得到的AMSCs具有MSCs的形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志，，符合MSCs的生長(zhǎng)、增殖特點(diǎn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示該細(xì)胞表達(dá)CD73、CDl05，不表達(dá)CD45和HLA-DR。AMSCs誘導(dǎo)前不表達(dá)NSE，弱表達(dá)GFAP，經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物NSE、GFAP。 2.成功分離、純化的MI形態(tài)上細(xì)胞體呈細(xì)長(zhǎng)或橢圓,從胞體發(fā)出細(xì)小而有分支的突起。CD68免疫熒光染色陽(yáng)性的細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞總數(shù)的95%以上，MI純度較高。 3.MI經(jīng)LPS刺激后活化，細(xì)胞呈阿米巴樣外觀，MAC-1免疫熒光陽(yáng)性，靜息狀態(tài)的MI自身能分泌微量的TNF-α和IL-6，激活后上清液中炎性因子的含量明顯升高，激活前后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 第二部分羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活性及其可能機(jī)制研究 方法 1.免疫熒光染色法檢測(cè)AMSCs表面CD200的表達(dá)；ELISA檢測(cè)P2-P6AMSCs上CD200的表達(dá)。 2.免疫熒光染色法檢測(cè)MI表面CD200R的表達(dá)；ELISA檢測(cè)P1-P4MI上CD200R的表達(dá)。 3.AMSCs與MI體外共培養(yǎng)及抗CD200抗體阻斷實(shí)驗(yàn)。建立AMSCs和MI共培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)分組如下：MI組、MI+LPS組、MI+LPS+AMSCs組、MI+LPS+AMSCs+抗CD200抗體組、MI+LPS+AMSCs transwell組,共培養(yǎng)48h后觀察各組細(xì)胞的形態(tài);ELISA檢測(cè)各組上清中炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá),免疫熒光法、ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞表面CD200R的表達(dá)。 結(jié)果 1.AMSCs表達(dá)CD200，且P2-P6CD200的表達(dá)呈遞增趨勢(shì),至P6表達(dá)增加明顯,P2與P6差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0001)。 2.MI表達(dá)CD200R，CD200R在各代MI表面均有表達(dá)，與P1相比，其余各代OD值均升高，但各代間相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 3.在LPS作用下上清液中TNF-α和IL-6的分泌量較MI組顯著增加，而在LPS+MI+AMSCs組中，當(dāng)有AMSCs存在時(shí)，兩種炎性因子的分泌量呈明顯下降趨勢(shì)，LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組培養(yǎng)48h后，兩種細(xì)胞因子分泌量較LPS+MI+AMSCs組上升，但仍低于LPS+MI組；Transwell組兩種細(xì)胞因子分泌量較LPS+MI+AMSCs組明顯升高，與LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組比較無(wú)明顯差異。 4.免疫熒光法可見(jiàn)每組均有CD200R陽(yáng)性細(xì)胞，MI+LPS組較MI組熒光強(qiáng)度稍減弱，MI+LPS+AMSCs組CD200R比MI+LPS組明顯增強(qiáng)，抗CD200抗體組、Transwell組較MI+LPS組無(wú)明顯差異。 5.MI+LPS組CD200R的表達(dá)較MI組有所減少，當(dāng)有AMSCs存在時(shí)，CD200R的表達(dá)呈顯著上升趨勢(shì)，LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組培養(yǎng)48h后，CD200R的表達(dá)較LPS+MI+AMSCs組下降，但與LPS+MI組比較無(wú)明顯差異，Transwell組CD200R的表達(dá)較LPS+MI+AMSCs組明顯降低，與LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗體組比較差異不明顯。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用T檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.AMSCs表面表達(dá)CD200，MI表面表達(dá)CD200R。 2.AMSCs與MI共培養(yǎng)可使活化MI表面CD200R的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)CD200-CD200R的直接接觸對(duì)活化的MI發(fā)揮免疫抑制作用，調(diào)節(jié)MI的活化程度，減少炎性細(xì)胞因子分泌,抗CD200抗體能夠逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。
【圖文】：

顯示，細(xì)胞在接種后的2-8天為生長(zhǎng)的洲細(xì)胞逐漸開(kāi)始出現(xiàn)貼壁，無(wú)明顯擴(kuò)增;8天以后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增殖活湘差顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞突起向四周伸展，出?

原代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741;R457.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 喬?hào)|訪;崔桐輝;王慧君;譚曉輝;李艷紅;;氧化應(yīng)激條件下CD200對(duì)MG炎性反應(yīng)的調(diào)控作用[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2008年10期

2 李慧;顧健;林傳明;馬莉;沈連軍;吳蔚;汪中強(qiáng);;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)CIA大鼠炎癥因子的干預(yù)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年36期

3 劉萍萍;李倩如;朱敬松;軒小燕;管莎莎;杜英;;間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)EAE小鼠Treg細(xì)胞功能的影響[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2013年10期

本文編號(hào)：2581724