【摘要】：目的： 本文旨在觀察甲基鳥嘌呤甲基轉移酶（MGMT）抑制劑丙戊酸鈉(VPA)聯(lián)合抗腫瘤藥物替莫唑胺(TMZ)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251、SHG44的體外抗瘤效應；探討其可能的相關機制。為以TMZ為基礎的膠質(zhì)瘤聯(lián)合化療提供實驗依據(jù)。 方法： 1、丙戊酸鈉、替莫唑胺單獨對U251、SHG44細胞體外作用的研究 （1）給藥方案：兩種膠質(zhì)瘤細胞分別給以不同濃度的替莫唑胺或丙戊酸鈉，并以空白組做為對照。 （2）體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤U251、SHG44細胞，培養(yǎng)至80%細胞密度時，按照上述分組給予藥物干預，作用48小時，采用MTT比色法檢測各組細胞增殖情況變化。選取兩種藥物的最適濃度進行后續(xù)試驗。 2、丙戊酸鈉聯(lián)合替莫唑胺對U251、SHG44細胞體外作用的研究 （1）實驗分組：1.空白對照組；2.替莫唑胺單獨用藥組；3.丙戊酸鈉單獨用藥組；4.丙戊酸鈉和替莫唑胺聯(lián)合用藥組。 （2）體外培養(yǎng)U251、SHG44細胞，按照上述分組給藥，，作用48小時后，進行以下實驗：1.倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；2.MTT比色法檢測細胞增殖變化；3.流式檢測細胞凋亡變化；4.DAPI染色法熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)學變化。 （3）PI染色后流式細胞儀上檢測各組細胞周期變化。 3、丙戊酸鈉聯(lián)合替莫唑胺對神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤作用的可能機制研究 體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤U251細胞，應用Western Blotting法檢測各組細胞中E-cadherin、c-Myc及cyclin-D1、capase-3、capase-8、p-53、Bax和Bcl-2的表達。 結果： 1、丙戊酸鈉、替莫唑胺單獨對U251、SHG44細胞體外作用的影響 MTT比色法檢測丙戊酸鈉、替莫唑胺分別作用后U251、SHG44細胞增殖情況：結果顯示，TMZ及VPA對兩種膠質(zhì)瘤細胞生長均有抑制作用，并隨著藥物濃度的增加，增值速度逐漸下降，呈劑量依賴性。 在后續(xù)試驗中，即VPA與TMZ聯(lián)合用藥時，我們主要是為了利用VPA作用于細胞，抑制MGMT活性，提高膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的敏感性，故我們選擇TMZ的半數(shù)抑制濃度即1mmol/l，而VPA選擇1mmol/l、2mmol/l的低抑制濃度進行以后的一系列試驗。 2、丙戊酸鈉聯(lián)合替莫唑胺對U251、SHG44細胞體外作用的影響 (1)藥物干預后，應用倒置相差顯微鏡觀察SHG44細胞形態(tài)學變化：1.空白對照組的細胞數(shù)目較多，細胞透亮，呈梭形且貼壁生長，折光性好。2.相比對照組，單用替莫唑胺組細胞數(shù)量減少，細胞體積縮小、變圓，透亮度及折光性減弱，胞間連接減少；單用丙戊酸鈉的兩組細胞狀態(tài)與對照組相比無明顯差別。聯(lián)合用藥組較對照組細胞體積縮小、折光性減弱更加明顯，并有漂浮細胞出現(xiàn)，培養(yǎng)基渾濁。并隨丙戊酸鈉濃度增加，細胞形態(tài)變化越明顯。 (2)MTT比色法檢測聯(lián)合用藥對U251、SHG44細胞增殖的影響：結果顯示，SHG44細胞替莫唑胺組OD值為：0.86±0.02，丙戊酸鈉組OD值分別為0.72±0.03、0.62±0.03，聯(lián)合用藥組OD值分別為0.63±0.03、0.49±0.03；U251細胞替莫唑胺組OD值為0.86±0.07，丙戊酸鈉組OD值分別為0.86±0.09、0.66±0.07，聯(lián)合用藥組OD值分別為0.73±0.05、0.50±0.12。與空白對照組相比較，其他各藥物干預組OD值均明顯降低(p0.01)，表明細胞增殖速度下降；實驗結果還表明，相比丙戊酸鈉、替莫唑胺單獨用藥，聯(lián)合用藥使兩種細胞的增殖速度更為顯著的下降(p0.01)。 （3）流式檢測藥物干預后U251、SHG44細胞凋亡率變化：流式細胞儀檢測兩組細胞對照組、丙戊酸鈉組、替莫唑胺組、聯(lián)合用藥組細胞凋亡率分別為：SHG44細胞：3.3%，4.1%，7.5%，29.4%，53.7%，72.5%；U251細胞：2.7%，3.2%，3.4%，12.0%，29.8%，33.2%。與對照組相比，兩種細胞中丙戊酸鈉組細胞凋亡不明顯，替莫唑胺組細胞的凋亡率顯著增加（p0.01)，而聯(lián)合用藥組細胞的凋亡率比明顯高于丙戊酸鈉組和替莫唑胺組(p0.01)。 （4）藥物干預后各組細胞經(jīng)DNA熒光染料DAPI染色，應用熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)變化。DAPI染色的正常細胞核無固縮，呈體積較大的淺染核形態(tài)，核內(nèi)DNA分布相對均勻；若細胞凋亡，凋亡細胞核出現(xiàn)不同程度的固縮，呈致密濃染的深染核形態(tài)，核內(nèi)DNA濃聚，有細胞凋亡的典型特征。本實驗染色結果表明，空白對照組和丙戊酸鈉組均少有細胞凋亡；替莫唑胺組細胞凋亡數(shù)量增多；聯(lián)合用藥組細胞凋亡更加顯著。 （5）采用PI染色后流式細胞儀上檢測SHG44各組細胞周期變化。結果顯示，相比對照組（S期19.40%），替莫唑胺組使細胞S期占42.57%（p0.05），聯(lián)合用藥組S期比值增至74.30%（p0.05）；且相對而言，G1期細胞比例由對照組的75.61%降低至替莫唑胺作用后的48.37%（p0.05），而聯(lián)合用藥后這一比例更為顯著的降低至25.70%（p0.05）。以上結果說明TMZ作用于膠質(zhì)瘤細胞后，可使細胞停滯于G1-S期，并且丙戊酸鈉能顯著增強替莫唑胺對細胞周期的抑制作用。 3、丙戊酸鈉聯(lián)合替莫唑胺對神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞作用的可能機制研究 Western Blotting法檢測藥物作用后U251細胞中E-cadherin、c-Myc及cyclin-D1、capase-3、capase-8、p-53、Bax和Bcl-2的表達情況：與對照組比較，丙戊酸鈉組E-cadherin、c-Myc、cyclin-D1、capase-3、capase-8、p53及Bcl-2、Bax表達無明顯差別，替莫唑胺組和聯(lián)合用藥組E-cadherin、c-Myc、cyclin-D1、capase-3、capase-8及Bax表達上調(diào)，p53、Bcl-2的表達水平下調(diào)，聯(lián)合用藥組上述蛋白相應的表達水平變化較替莫唑胺組更為明顯。 結論： 1、替莫唑胺及丙戊酸鈉均能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞瘤U251、SHG44生長，并呈劑量依賴性； 2、丙戊酸鈉增強了替莫唑胺對U251、SHG44細胞凋亡形態(tài)學變化，更為明顯抑制細胞增殖，細胞周期停滯，促進細胞凋亡； 3、丙戊酸鈉聯(lián)合替莫唑胺促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤U251、SHG44細胞凋亡可能是通過調(diào)節(jié)多種凋亡相關蛋白的表達水平來實現(xiàn)的。 4、丙戊酸鈉增強了神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤U251、SHG44細胞對替莫唑胺的化療敏感性。
【圖文】：

多形性成膠質(zhì)細胞瘤（Glioblastoma multiforme形膠質(zhì)細胞瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最普遍的治療原則是以手術切除為主，術后放、化療等的理想[2,3]。GBM 的治療在化療方面取得了一些新的e, TMZ)（圖 1.1）是一種新型抗腫瘤烷化劑[4]，法簡便、易于透過血腦屏障、與其他藥物沒有疊的患者[5]而引起國內(nèi)外學者的廣泛關注。TMZ 衍生物，其口服后可被人體迅速吸收，并且吸收 TMZ 后，其藥物作用廣泛分布于全身，較，進入腦脊液，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)達到有效的藥物藥物濃度比接近 30%～40%[7]。

藥物干預后神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤SHG44細胞形態(tài)學變化(×400)
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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10 張俊平;賽克;魏大年;牟永告;張湘衡;吳秋良;陳忠平;;MGMT陽性惡性腦膠質(zhì)瘤病人的化療(附51例體會)[J];中華神經(jīng)外科雜志;2007年09期

本文編號：2580989