發(fā)布時間：2019-12-05 20:26

【摘要】：目的設(shè)計和構(gòu)建特異性siRNA納米載體SWCNT-siRNA,通過體外實驗,研究其對腦膠質(zhì)瘤的作用。方法設(shè)計合成特異性Bcl-2 siRNA,利用超聲技術(shù)合成SWCNT-siRNA復(fù)合物,動態(tài)散射粒度分析儀進行粒徑分析;體外培養(yǎng)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,SWCNT-siRNA復(fù)合物處理細(xì)胞后,激光共聚焦顯微鏡追蹤siRNA進入細(xì)胞的分布。PCR檢測靶基因Bcl-2沉默情況,Annexin-V FITC與PI聯(lián)合標(biāo)記細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果通過粒徑分析證明siRNA成功纏繞到SWCNT上形成穩(wěn)定的復(fù)合物siRNA-SWCNT。利用激光共聚焦顯微鏡對標(biāo)記紅色熒光的siRNA進行追蹤,發(fā)現(xiàn)siRNA成功投遞到細(xì)胞內(nèi)。PCR驗證了被投遞到胞漿的siRNA很好的沉默目標(biāo)基因Bcl-2。通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn),與對照組比較發(fā)現(xiàn)其可以抑制腫瘤細(xì)胞生長,促進腫瘤細(xì)胞早期凋亡。結(jié)論 SWCNT作為納米載體投遞Bcl-2 siRNA進入U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞,通過降解Bcl-2 mRNA抑制Bcl-2的表達(dá)并促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

，mitotracker標(biāo)記線粒體用于定位。如圖3，結(jié)果顯示對照組（control）中無紅色熒光，siRNA組和SWCNT-siRNA組中有紅色熒光。在后兩組中，發(fā)現(xiàn)SWCNT-siRNA組的熒光強度明細(xì)強于siRNA組。結(jié)果表明，siRNA被成功投遞進入U251細(xì)胞，SWCNT-siRNA比siRNA的投遞效率明顯高。圖2不同濃度（siRNA0，50,100,150,200nmol/L）SWCNT-siRNA處理U251細(xì)胞12h（A）和24h（B）后活性分析Fig.2CellviabilityofU251cellsincubatedwithSWCNT-siRNAatdifferentconcentrations(siRNA0，50,100,150,200nmol/L)for12h(A)andanadditional48h(B)圖1動態(tài)光散射分析SWCNT-siRNA復(fù)合物Fig.1DynamiclightscatteringmeasurementofSWCNT-siRNAcomplex2.4熒光PCR分析結(jié)果為進一步證明抑制Bcl-2的表達(dá)，是通過進入細(xì)胞的siRNA發(fā)揮作用的。采用熒光PCR分析siRNA、SWCNT-siRNA處理細(xì)胞24h后Bcl-2mRNA含量與對照組做比較，如圖4。統(tǒng)計結(jié)果顯示，siRNA、SWCNT-siRNA與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），SWCNT-siRNA與siRNA相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.00），SWCNT-siRNA組約70%mRNA被降解掉，說明本研究的設(shè)計的siRNA載體的投遞效率較高。2.5U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果本實驗采用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞儀分析U251細(xì)胞的凋亡情況。細(xì)胞分別與siRNA和SWCNT-siRNA共培養(yǎng)12h后，換上新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞按照試劑盒的說明書上的方法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果如圖。在圖5中，早期凋亡細(xì)胞分布右下象限中，SWCNT-siRNA處理細(xì)胞后凋亡細(xì)胞比例從8.27%增加到42.23%；晚期死亡細(xì)胞分布在右上象限中,SWCNT-siRNA與對照組比較沒有顯著差異。實驗重復(fù)3次。經(jīng)統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，SWCNT-siRNA組中的活細(xì)胞及早期凋亡細(xì)胞所占的比

中國臨床解剖學(xué)雜志2017年第35卷第5期L。結(jié)果用統(tǒng)計圖表示，如圖2。各實驗組中細(xì)胞的存活率均為90%上，與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.01）。因此，SWCNT-siRNA具有低毒性，在小于200nmol/L和48h內(nèi)，可以安全使用。2.3細(xì)胞攝取siRNA實驗實驗設(shè)計3組，分別為對照組（control）、siRNA、和SWCNT-siRNA，其中各組中siRNA的濃度為100nmol/L與細(xì)胞處理12h，并用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，mitotracker標(biāo)記線粒體用于定位。如圖3，結(jié)果顯示對照組（control）中無紅色熒光，siRNA組和SWCNT-siRNA組中有紅色熒光。在后兩組中，發(fā)現(xiàn)SWCNT-siRNA組的熒光強度明細(xì)強于siRNA組。結(jié)果表明，siRNA被成功投遞進入U251細(xì)胞，SWCNT-siRNA比siRNA的投遞效率明顯高。圖2不同濃度（siRNA0，50,100,150,200nmol/L）SWCNT-siRNA處理U251細(xì)胞12h（A）和24h（B）后活性分析Fig.2CellviabilityofU251cellsincubatedwithSWCNT-siRNAatdifferentconcentrations(siRNA0，50,100,150,200nmol/L)for12h(A)andanadditional48h(B)圖1動態(tài)光散射分析SWCNT-siRNA復(fù)合物Fig.1DynamiclightscatteringmeasurementofSWCNT-siRNAcomplex2.4熒光PCR分析結(jié)果為進一步證明抑制Bcl-2的表達(dá)，是通過進入細(xì)胞的siRNA發(fā)揮作用的。采用熒光PCR分析siRNA、SWCNT-siRNA處理細(xì)胞24h后Bcl-2mRNA含量與對照組做比較，，如圖4。統(tǒng)計結(jié)果顯示，siRNA、SWCNT-siRNA與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），SWCNT-siRNA與siRNA相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.00），SWCNT-siRNA組約70%mRNA被降解掉，說明本研究的設(shè)計的siRNA載體的投遞效率較高。2.5U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果本實驗采用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞儀分析U251細(xì)胞的凋亡情況。細(xì)胞分別與siRNA和SWCNT-siRNA共培養(yǎng)12h后

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