【摘要】：目的:已有研究表明,程序性壞死抑制劑Necrostatin-1可抑制腦缺血后神經元發(fā)生程序性壞死。本課題主要探討程序性壞死抑制劑Necrostatin-1對腦缺血再灌注損傷后少突膠質前體細胞(OPC)、白質損傷以及小鼠遠期神經功能恢復的作用及機制研究。方法:1.體外實驗:本課題利用原代小鼠OPC在OGD條件下培養(yǎng)2小時后恢復正常OPC培養(yǎng)基建立體外缺血再灌注損傷模型。分別將程序性壞死抑制劑Necrostatin-1,廣譜的凋亡抑制劑Z-VAD-fmk,以及陰性對照組DMSO加入OPC培養(yǎng)基中預處理1小時,然后將其置于缺糖缺氧條件下培養(yǎng)2小時后換成正常OPC培養(yǎng)基。本課題利用碘化吡啶(propidiumiodide,PI)和Calcein-AM(C-AM)共染色檢測細胞死亡率、MTT方法檢測OGD處理后24小時的細胞存活率,使用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放實驗檢測細胞膜通透性間接反映細胞壞死情況,并分別于OGD處理后6小時,12小時以及24小時提取OPC總蛋白。通過Western blot方法檢測OPC中受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1),受體相互作用蛋白激酶 3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3),混合系激酶樣結構蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)及磷酸化的混合系激酶樣結構蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein,P-MLKL)的表達水平。2.體內實驗:成年雄性ICR小鼠(25-30g)作為實驗用動物,使用線栓阻塞小鼠大腦中動脈的方法(MCAO)建立體內腦缺血再灌注損傷模型(缺血60分鐘后恢復血流供應24小時)。在MCAO開始前1小時,本課題利用腦立體定位儀進行定位,使用微量進樣器分別將Necrostatin-1、DMSO(0.04mg/kg)注射至不同分組小鼠右側側腦室中。MCAO術后24小時,將小鼠脫臼處死,從小鼠全腦中取出腦室下區(qū)(SVZ)和胼胝體(CC)組織,并加入RIPA蛋白裂解液提取組織總蛋白,通過Western blot方法檢測富含OPC的SVZ和CC部位RIPK1,RIPK3,MLKL 及P-MLKL蛋白的表達水平變化情況。本課題通過免疫熒光染色觀察小鼠MCAO后SVZ和CC中OPC的幸存情況,并利用LuxolFastBlue(LFB)染色檢測腦白質損傷,通過足錯誤實驗和Morris水迷宮實驗評估小鼠MCAO后遠期神經功能恢復情況。結果:1.體外實驗(1)OGD損傷可導致PI標記的OPC數量明顯增多(P0.001),與OGD組相比較,Necrostatin-1可顯著地減少PI標記的壞死的OPC(P0.001);通過MTT實驗檢測OGD對OPC存活率的影響,OGD損傷后OPC存活率明顯減少(P0.001),與OGD組相比,Necrostatin-1可增加OPC存活率(P0.05);利用LDH實驗檢測細胞膜通透性間接反映細胞壞死情況,結果發(fā)現(xiàn)OGD損傷可促進OPC釋放LDH(P0.001),與OGD組相比,Necrostatin-1則能明顯抑制LDH的釋放(P0.001)。然而,與OGD組相比,廣譜的凋亡抑制劑Z-VAD-fmk并沒有明顯減少PI標記的壞死的OPC、OPC存活率以及OPC釋放LDH(P0.05)。(2)OGD后6小時RIPK1蛋白表達水平明顯上調(P0.05),RIPK3表達水平則在OGD后12小時顯著升高(P0.01)。本課題還進一步發(fā)現(xiàn)在OGD后24小時,RIPK3的下游靶蛋白MLKL表達水平也出現(xiàn)了明顯的上調(P0.05),且MLKL蛋白升高的主要成分是磷酸化的MLKL(P-MLKL),即程序性壞死的執(zhí)行蛋白(P0.05)。(3)Necrostatin-1可顯著地抑制OGD損傷后OPC中RIPK1蛋白的表達(P0.05)以及RIPK3的表達水平(P0.01),另外,Necrostatin-1還能明顯下調OGD后OPC中MLKL和P-MLKL蛋白的表達水平(P0.05)。2.體內實驗(1)與sham組相比,小鼠MCAO后24小時,損傷側SVZ和CC部位RIPK1和RIPK3蛋白水平均顯著升高(P0.05)。同時,與sham組相比,小鼠MCAO后損傷側SVZ和CC部位的MLKL及P-MLKL蛋白表達也明顯地上調(P0.05)。(2)與vehicle組損傷側半球相比,Necrostatin-1顯著地抑制了小鼠MCAO后24小時損傷側SVZ及CC部位RIPK1蛋白的表達(P0.05),并能下調RIPK3蛋白在損傷側SVZ(P0.05)和CC(P0.01)部位的表達。Necrostatin-1組與vehicle組相比,損傷側SVZ和CC部位MLKL蛋白的表達水平也明顯地下降(P0.05)。本課題還觀察到,與vehicle組相比,Necrostatin-1顯著地抑制了損傷側SVZ和CC部位P-MLKL的表達水平(P0.05)。(3)與vehicle組相比,在損傷側CC部位Necrostatin-1明顯地增加了 NG2-陽性的OPC數量(P0.05)。本課題通過LFB染色評估白質損傷情況,結果發(fā)現(xiàn):與vehicle組相比,Necrostatin-1組損傷側CC部位LFB-陽性的髓鞘密度明顯地增加(P0.05)。(4)通過Morris水迷宮和足錯誤實驗測定小鼠行為學改善情況。在Morris水迷宮實驗中,Necrostatin-1組小鼠逃避潛伏期明顯少于vehicle組(P0.05)。平臺被移去后,與vehicle組相比,Necrostatin-1組小鼠穿過目標象限的次數顯著地增加(P0.05),并且Necrostatin-1組的小鼠在目標象限停留的時間顯著長于vehicle組(P0.01)。在足錯誤實驗中,Necrostatin-1組小鼠左前肢與右前肢足錯誤的步數的差值明顯小于vehicle組(P0.01)。結論:缺血性損傷可以誘導OPC發(fā)生程序性壞死,而且是依賴于腦缺血后誘導RIPK1,RIPK3,MLKL以及P-MLKL蛋白表達上調的壞死過程。我們的研究發(fā)現(xiàn):在腦缺血再灌注損傷后程序性壞死的抑制劑Necrostatin-1可通過抑制RIPK1,RIPK3,MLKL及P-MLKL蛋白表達從而促進OPC的幸存并能改善小鼠缺血性腦白質損傷和遠期神經功能的恢復。研究結果將為治療缺血性腦卒中引起的白質損傷提供新的靶點和理論基礎。
【圖文】：

圖２．邋ＯＧＤ損傷誘導原代小鼠ＯＰＣ中ＰＩＰＫ１，邋Ｒ丨ＰＫ３，邋ＭＬＫＬ及ＩＭＶ１ＬＫＬ蛋白的表達上調。原代小逡逑鼠０ＰＣ在缺糖缺氧條件下培養(yǎng)２小時，分別于ＯＧＤ損傷后６小時、１２小時、２４小時向ＯＰＣ培養(yǎng)孔逡逑中加入ＲＩＰＡ蛋白裂解液提取細胞總蛋白。（Ａ）ＲＩＰＫｌ，ＲＩＰＫ３，邋ＭＬＫＬ以及Ｐ－ＭＬＫＬ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑代表圖；（Ｂ）邋ＲＩＰＫ丨與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｃ）邋ＲＩＰＫ３邋與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｄ）邋ＭＬＫＬ邋與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｅ）逡逑Ｐ－ＭＬＫＬ邋與Ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值。Ｂａｒｓ邋代表均數士標準誤（ｎ＝６邋每組）。＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１邋ｖｓ邋對照組（Ｃｔｒｌ）。逡逑３．邋Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１可抑制ＯＧＤｔ貝傷后小鼠原代ＯＰＣ中程序性壞死相關蛋白的逡逑表達水平并能減少磷酸化的ＭＬＫＬ表達逡逑Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１顯著地抑制了邋０ＧＤ損傷后０ＰＣ中ＲＩＰＫ１蛋白的表達（ｉ＾Ｏ．Ｃ＾Ｆｉｇ．邋３Ａ逡逑和３Ｃ）以及ＲＩＰＫ３的表達水平（Ｐ＜０．０１，Ｆｉｇ．邋３Ｂ和３Ｄ）。該項研宄結果進一步表明逡逑Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１邋可明顯下調邋０ＧＤ邋損傷后邋０ＰＣ邋中邋ＭＬＫＬ邋蛋白（Ｐ＜０．０５，Ｆｉｇ．邋３Ｅ邋和邋３Ｆ）和逡逑Ｐ－ＭＬＫＬ蛋白（Ｐ＜０．０５，邋Ｆｉｇ．３Ｅ和３Ｇ）的表達水平。逡逑

圖３．邋Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－ｌ可抑制ＯＧＤ損傷后小鼠原代ＯＰＣ中程序性壞死相關蛋白的表達水平并能減少磷酸逡逑化的ＭＬＫＬ表達。程序性壞死抑制劑或者陰性對照組ＤＭＳＯ加入ＯＰＣ培養(yǎng)基中預處理１小時，然后逡逑置于缺糖缺氧條件下培養(yǎng)２小時后將其換至正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)。（Ａ）ＯＧＤ損傷后６小時ＯＰＣ中Ｒ丨ＰＫＩ逡逑和ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白表達水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ代表圖；（Ｂ）邋ＯＧＤ損傷后１２小時ＯＰＣ中ＲＩＰＫ３和ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白逡逑表達水平的邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋代表圖；（Ｃ）邋ＲＩＰＫ１邋與邋ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｄ）邋Ｒ１ＰＫ３邋與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｅ）邋ＯＧＤ逡逑損傷后２４小時ＯＰＣ中ＭＬＫＬ，邋Ｐ－ＭＬＫＬ邋ｆｌｉｐ－ａｃｔｉｎ蛋白表達水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ代表圖；（Ｆ）邋ＭＬＫＬ逡逑與ｐ－ａｃｔｉｎ的比值；（Ｇ）邋Ｐ－ＭＬＫＬ與ｐ－ａｃｔｉｎ的比值。Ｂａｒｓ代表均數土標準誤（ｎ＝６每組）。＃尸＜０．０５，料尸＜０．０１逡逑ｖｓＯＧＤ邋組。逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743

【參考文獻】

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1 Mahdi Goudarzvand;Sanaz Afraei;Somaye Yaslianifard;Saleh Ghiasy;Ghazal Sadri;Mustafa Kalvandi;Tina Alinia;Ali Mohebbi;Reza Yazdani;Shahin Khadem Azarian;Abbas Mirshafiey;Gholamreza Azizi;;Hydroxycitric acid ameliorates inflammation and oxidative stress in mouse models of multiple sclerosis[J];Neural Regeneration Research;2016年10期

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本文編號：2568984