【摘要】：目的:已有研究表明,程序性壞死抑制劑Necrostatin-1可抑制腦缺血后神經(jīng)元發(fā)生程序性壞死。本課題主要探討程序性壞死抑制劑Necrostatin-1對(duì)腦缺血再灌注損傷后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPC)、白質(zhì)損傷以及小鼠遠(yuǎn)期神經(jīng)功能恢復(fù)的作用及機(jī)制研究。方法:1.體外實(shí)驗(yàn):本課題利用原代小鼠OPC在OGD條件下培養(yǎng)2小時(shí)后恢復(fù)正常OPC培養(yǎng)基建立體外缺血再灌注損傷模型。分別將程序性壞死抑制劑Necrostatin-1,廣譜的凋亡抑制劑Z-VAD-fmk,以及陰性對(duì)照組DMSO加入OPC培養(yǎng)基中預(yù)處理1小時(shí),然后將其置于缺糖缺氧條件下培養(yǎng)2小時(shí)后換成正常OPC培養(yǎng)基。本課題利用碘化吡啶(propidiumiodide,PI)和Calcein-AM(C-AM)共染色檢測(cè)細(xì)胞死亡率、MTT方法檢測(cè)OGD處理后24小時(shí)的細(xì)胞存活率,使用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞膜通透性間接反映細(xì)胞壞死情況,并分別于OGD處理后6小時(shí),12小時(shí)以及24小時(shí)提取OPC總蛋白。通過Western blot方法檢測(cè)OPC中受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1),受體相互作用蛋白激酶 3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3),混合系激酶樣結(jié)構(gòu)蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)及磷酸化的混合系激酶樣結(jié)構(gòu)蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein,P-MLKL)的表達(dá)水平。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):成年雄性ICR小鼠(25-30g)作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物,使用線栓阻塞小鼠大腦中動(dòng)脈的方法(MCAO)建立體內(nèi)腦缺血再灌注損傷模型(缺血60分鐘后恢復(fù)血流供應(yīng)24小時(shí))。在MCAO開始前1小時(shí),本課題利用腦立體定位儀進(jìn)行定位,使用微量進(jìn)樣器分別將Necrostatin-1、DMSO(0.04mg/kg)注射至不同分組小鼠右側(cè)側(cè)腦室中。MCAO術(shù)后24小時(shí),將小鼠脫臼處死,從小鼠全腦中取出腦室下區(qū)(SVZ)和胼胝體(CC)組織,并加入RIPA蛋白裂解液提取組織總蛋白,通過Western blot方法檢測(cè)富含OPC的SVZ和CC部位RIPK1,RIPK3,MLKL 及P-MLKL蛋白的表達(dá)水平變化情況。本課題通過免疫熒光染色觀察小鼠MCAO后SVZ和CC中OPC的幸存情況,并利用LuxolFastBlue(LFB)染色檢測(cè)腦白質(zhì)損傷,通過足錯(cuò)誤實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠MCAO后遠(yuǎn)期神經(jīng)功能恢復(fù)情況。結(jié)果:1.體外實(shí)驗(yàn)(1)OGD損傷可導(dǎo)致PI標(biāo)記的OPC數(shù)量明顯增多(P0.001),與OGD組相比較,Necrostatin-1可顯著地減少PI標(biāo)記的壞死的OPC(P0.001);通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OGD對(duì)OPC存活率的影響,OGD損傷后OPC存活率明顯減少(P0.001),與OGD組相比,Necrostatin-1可增加OPC存活率(P0.05);利用LDH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞膜通透性間接反映細(xì)胞壞死情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGD損傷可促進(jìn)OPC釋放LDH(P0.001),與OGD組相比,Necrostatin-1則能明顯抑制LDH的釋放(P0.001)。然而,與OGD組相比,廣譜的凋亡抑制劑Z-VAD-fmk并沒有明顯減少PI標(biāo)記的壞死的OPC、OPC存活率以及OPC釋放LDH(P0.05)。(2)OGD后6小時(shí)RIPK1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P0.05),RIPK3表達(dá)水平則在OGD后12小時(shí)顯著升高(P0.01)。本課題還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在OGD后24小時(shí),RIPK3的下游靶蛋白MLKL表達(dá)水平也出現(xiàn)了明顯的上調(diào)(P0.05),且MLKL蛋白升高的主要成分是磷酸化的MLKL(P-MLKL),即程序性壞死的執(zhí)行蛋白(P0.05)。(3)Necrostatin-1可顯著地抑制OGD損傷后OPC中RIPK1蛋白的表達(dá)(P0.05)以及RIPK3的表達(dá)水平(P0.01),另外,Necrostatin-1還能明顯下調(diào)OGD后OPC中MLKL和P-MLKL蛋白的表達(dá)水平(P0.05)。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(1)與sham組相比,小鼠MCAO后24小時(shí),損傷側(cè)SVZ和CC部位RIPK1和RIPK3蛋白水平均顯著升高(P0.05)。同時(shí),與sham組相比,小鼠MCAO后損傷側(cè)SVZ和CC部位的MLKL及P-MLKL蛋白表達(dá)也明顯地上調(diào)(P0.05)。(2)與vehicle組損傷側(cè)半球相比,Necrostatin-1顯著地抑制了小鼠MCAO后24小時(shí)損傷側(cè)SVZ及CC部位RIPK1蛋白的表達(dá)(P0.05),并能下調(diào)RIPK3蛋白在損傷側(cè)SVZ(P0.05)和CC(P0.01)部位的表達(dá)。Necrostatin-1組與vehicle組相比,損傷側(cè)SVZ和CC部位MLKL蛋白的表達(dá)水平也明顯地下降(P0.05)。本課題還觀察到,與vehicle組相比,Necrostatin-1顯著地抑制了損傷側(cè)SVZ和CC部位P-MLKL的表達(dá)水平(P0.05)。(3)與vehicle組相比,在損傷側(cè)CC部位Necrostatin-1明顯地增加了 NG2-陽(yáng)性的OPC數(shù)量(P0.05)。本課題通過LFB染色評(píng)估白質(zhì)損傷情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與vehicle組相比,Necrostatin-1組損傷側(cè)CC部位LFB-陽(yáng)性的髓鞘密度明顯地增加(P0.05)。(4)通過Morris水迷宮和足錯(cuò)誤實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠行為學(xué)改善情況。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,Necrostatin-1組小鼠逃避潛伏期明顯少于vehicle組(P0.05)。平臺(tái)被移去后,與vehicle組相比,Necrostatin-1組小鼠穿過目標(biāo)象限的次數(shù)顯著地增加(P0.05),并且Necrostatin-1組的小鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間顯著長(zhǎng)于vehicle組(P0.01)。在足錯(cuò)誤實(shí)驗(yàn)中,Necrostatin-1組小鼠左前肢與右前肢足錯(cuò)誤的步數(shù)的差值明顯小于vehicle組(P0.01)。結(jié)論:缺血性損傷可以誘導(dǎo)OPC發(fā)生程序性壞死,而且是依賴于腦缺血后誘導(dǎo)RIPK1,RIPK3,MLKL以及P-MLKL蛋白表達(dá)上調(diào)的壞死過程。我們的研究發(fā)現(xiàn):在腦缺血再灌注損傷后程序性壞死的抑制劑Necrostatin-1可通過抑制RIPK1,RIPK3,MLKL及P-MLKL蛋白表達(dá)從而促進(jìn)OPC的幸存并能改善小鼠缺血性腦白質(zhì)損傷和遠(yuǎn)期神經(jīng)功能的恢復(fù)。研究結(jié)果將為治療缺血性腦卒中引起的白質(zhì)損傷提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖２．邋ＯＧＤ損傷誘導(dǎo)原代小鼠ＯＰＣ中ＰＩＰＫ１，邋Ｒ丨ＰＫ３，邋ＭＬＫＬ及ＩＭＶ１ＬＫＬ蛋白的表達(dá)上調(diào)。原代小逡逑鼠０ＰＣ在缺糖缺氧條件下培養(yǎng)２小時(shí)，分別于ＯＧＤ損傷后６小時(shí)、１２小時(shí)、２４小時(shí)向ＯＰＣ培養(yǎng)孔逡逑中加入ＲＩＰＡ蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。（Ａ）ＲＩＰＫｌ，ＲＩＰＫ３，邋ＭＬＫＬ以及Ｐ－ＭＬＫＬ蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑代表圖；（Ｂ）邋ＲＩＰＫ丨與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｃ）邋ＲＩＰＫ３邋與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｄ）邋ＭＬＫＬ邋與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｅ）逡逑Ｐ－ＭＬＫＬ邋與Ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值。Ｂａｒｓ邋代表均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤（ｎ＝６邋每組）。＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１邋ｖｓ邋對(duì)照組（Ｃｔｒｌ）。逡逑３．邋Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１可抑制ＯＧＤｔ貝傷后小鼠原代ＯＰＣ中程序性壞死相關(guān)蛋白的逡逑表達(dá)水平并能減少磷酸化的ＭＬＫＬ表達(dá)逡逑Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１顯著地抑制了邋０ＧＤ損傷后０ＰＣ中ＲＩＰＫ１蛋白的表達(dá)（ｉ＾Ｏ．Ｃ＾Ｆｉｇ．邋３Ａ逡逑和３Ｃ）以及ＲＩＰＫ３的表達(dá)水平（Ｐ＜０．０１，Ｆｉｇ．邋３Ｂ和３Ｄ）。該項(xiàng)研宄結(jié)果進(jìn)一步表明逡逑Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－１邋可明顯下調(diào)邋０ＧＤ邋損傷后邋０ＰＣ邋中邋ＭＬＫＬ邋蛋白（Ｐ＜０．０５，Ｆｉｇ．邋３Ｅ邋和邋３Ｆ）和逡逑Ｐ－ＭＬＫＬ蛋白（Ｐ＜０．０５，邋Ｆｉｇ．３Ｅ和３Ｇ）的表達(dá)水平。逡逑

圖３．邋Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ－ｌ可抑制ＯＧＤ損傷后小鼠原代ＯＰＣ中程序性壞死相關(guān)蛋白的表達(dá)水平并能減少磷酸逡逑化的ＭＬＫＬ表達(dá)。程序性壞死抑制劑或者陰性對(duì)照組ＤＭＳＯ加入ＯＰＣ培養(yǎng)基中預(yù)處理１小時(shí)，然后逡逑置于缺糖缺氧條件下培養(yǎng)２小時(shí)后將其換至正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)。（Ａ）ＯＧＤ損傷后６小時(shí)ＯＰＣ中Ｒ丨ＰＫＩ逡逑和ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白表達(dá)水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ代表圖；（Ｂ）邋ＯＧＤ損傷后１２小時(shí)ＯＰＣ中ＲＩＰＫ３和ｐ－ａｃｔｉｎ蛋白逡逑表達(dá)水平的邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋代表圖；（Ｃ）邋ＲＩＰＫ１邋與邋ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｄ）邋Ｒ１ＰＫ３邋與ｐ－ａｃｔｉｎ邋的比值；（Ｅ）邋ＯＧＤ逡逑損傷后２４小時(shí)ＯＰＣ中ＭＬＫＬ，邋Ｐ－ＭＬＫＬ邋ｆｌｉｐ－ａｃｔｉｎ蛋白表達(dá)水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ代表圖；（Ｆ）邋ＭＬＫＬ逡逑與ｐ－ａｃｔｉｎ的比值；（Ｇ）邋Ｐ－ＭＬＫＬ與ｐ－ａｃｔｉｎ的比值。Ｂａｒｓ代表均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤（ｎ＝６每組）。＃尸＜０．０５，料尸＜０．０１逡逑ｖｓＯＧＤ邋組。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743

【參考文獻(xiàn)】

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1 Mahdi Goudarzvand;Sanaz Afraei;Somaye Yaslianifard;Saleh Ghiasy;Ghazal Sadri;Mustafa Kalvandi;Tina Alinia;Ali Mohebbi;Reza Yazdani;Shahin Khadem Azarian;Abbas Mirshafiey;Gholamreza Azizi;;Hydroxycitric acid ameliorates inflammation and oxidative stress in mouse models of multiple sclerosis[J];Neural Regeneration Research;2016年10期

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本文編號(hào)：2568984