【摘要】：背景：腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50%，其具有高發(fā)病率及致死率的特點。傳統(tǒng)的治療方法包括手術，放療，化療，但治療效果仍較差，尤其是針對膠質母細胞瘤，即使應用上述綜合治療，其平均生存期尚不足14.6個月。隨著人們對膠質瘤發(fā)病機制的進一步認識，神經(jīng)肽類物質在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關注。促腎上腺激素釋放因子（corticotropin-releasing factor CRF）是一類最早由vale從羊下丘腦中分離出的含有41個氨基酸的激素類神經(jīng)肽。主要分布于人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以下丘腦為著，外周系統(tǒng)中分布廣泛。CRF主要作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA），調節(jié)機體在應激狀態(tài)下的內(nèi)分泌，自主神經(jīng)，免疫反應等方面的協(xié)調。近年來，CRF作為一類重要的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，其在腫瘤方面的作用也逐漸被重視起來。CRF對其他系統(tǒng)腫瘤的作用表現(xiàn)在：CRF可以通過CRFR1的激活抑制乳腺癌細胞生長；CRF通過CRFR2的激活抑制人小細胞肺癌細胞的生長；尿皮素通過CRFR2抑制肝細胞癌的腫瘤生長和血管的生成。但是，CRF對腦膠質瘤的作用及機制國內(nèi)外鮮有報道。 目的：探索CRF對U87細胞凋亡的作用和在不同濃度的CRF作用下，對U87細胞中CRFR1，PCNA，caspase-3， cytC蛋白表達的影響及fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表達的影響。 方法： 1CCK8法檢測U87細胞凋亡 復蘇U87細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組置3個重復孔。37℃，5%CO2，濕化空氣培養(yǎng)24h后，更換入含有CRF的DMEM培養(yǎng)基（濃度分別為0，10-7，10-8，10-9mol/L），設立空白對照組（不含CRF及細胞）,在24h時間點加入cck-8(10ul/孔)，培養(yǎng)箱中作用3h后檢測細胞的OD值（450nm）。 2Western-blot檢測CRFR1，PCNA，caspase-3，，cytC蛋白表達 提取24h組細胞總蛋白，勻漿器勻漿，BCA法蛋白濃度定量，加入上樣緩沖液煮沸5min，總蛋白60μg上樣到10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白質轉印至PVDF膜，轉膜條件為205mA，1.5h。5%脫脂奶粉室溫封閉2h后，TBS漂洗3次，每次5分鐘。CRFR1(1:500)，PCNA（1:800），caspase-3（1:800），cytC (1:800)，β-actin(1:500)在上述一抗溶液中4℃孵育過夜。TBS洗膜5min，羊抗兔二抗溶液中常溫孵育60min�；瘜W發(fā)光儀中發(fā)光成像，并經(jīng)Image J對蛋白條帶進行灰度分析，計算蛋白相對值=蛋白A值/β-actin值。 3熒光定量PCR檢測fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表達 Trizol法提取細胞總RNA，1.2%凝膠電泳檢測其完整性。按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA,進行聚合酶鏈反應。應用DNAman軟件設計fas/fasl，Bcl-2/Bax引物序列，由北京賽百盛公司合成。置于AB7300PCR儀，95℃變性5min；95℃變性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；最后，產(chǎn)物在72℃延伸5min。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mRNA轉錄水平的差異，，記錄結果數(shù)據(jù)。 結果： 1CCK-8細胞凋亡檢測：不同濃度CRF處理的U87細胞凋亡率存在差異，有統(tǒng)計學意義（F=35.79，P0.05）。 2Western-blot檢測：CRFR1蛋白的實驗組高于對照組,差異顯著(F=83.32,P 0.05)。PCNA蛋白的實驗組高于對照組,差異顯著(F=36.19,P 0.05)。cytC蛋白的實驗組高于對照組,差異顯著(F=11.93,P 0.05)。caspase-3蛋白的實驗組高于對照組,差異顯著(F=44.82,P 0.05)。 3熒光定量PCR檢測： Bcl-2mRNA的實驗組低于對照組,差異顯著(F=138.82,P 0.05)。Bax mRNA的實驗組高于對照組,差異顯著(F=215.25,P 0.05)。不同濃度CRF干預的U87細胞Fas mRNA的表達不全相同，有統(tǒng)計學意義(F=14.5,P 0.05)。不同濃度CRF處理的U87細胞Fasl mRNA的表達不全相同，有統(tǒng)計學意義(F=54.14,P 0.05)。 結論： 1CCK8實驗顯示CRF對膠質瘤U87MG具有促進凋亡的作用。 2Western-blot印跡結果顯示CRF可以上調CRFR1的表達，凋亡相關蛋白capase-3，cytC的表達與細胞凋亡趨勢一致，PCNA蛋白表達顯示細胞周期阻滯在G2期之前。 3熒光定量PCR結果顯示Bcl-2/Bax，fas/fasl mRNA的表達與細胞凋亡趨勢一致。 綜上所述，CRF在一定程度上促進了U87細胞的凋亡，且這有可能通過上述凋亡因子及凋亡途徑對U87細胞發(fā)揮作用。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：2568187