【摘要】：腦缺血是一種由于組織血流供應(yīng)不足所引起腦組織損傷的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。缺血腦組織中的糖氧水平快速下降,導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷,并最終影響神經(jīng)功能。腦缺血嚴(yán)重危害著人類健康,目前尚無(wú)有效治療手段。腦缺血病理過(guò)程十分復(fù)雜,缺血啟動(dòng)了多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,其中包括細(xì)胞自噬。自噬是指一種通過(guò)溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)大分子,回收利用多余或異常蛋白、細(xì)胞器的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。自噬對(duì)于維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對(duì)應(yīng)激狀態(tài)非常重要,與多種人類疾病密切相關(guān)。近年的研究表明,細(xì)胞自噬可能也參與了腦缺血損傷的病理過(guò)程,然而其作用還存在爭(zhēng)議：通過(guò)抑制自噬可以緩解局灶性腦缺血及神經(jīng)退行性損傷,而另一些研究也提出了自噬可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此,自噬在缺血性腦損傷中的作用仍有待明確。此外,通過(guò)自噬途徑降解細(xì)胞內(nèi)損傷或多余線粒體稱作線粒體自噬,腦缺血過(guò)程中伴隨大量線粒體損傷,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,損傷線粒體的清除有助于細(xì)胞存活。線粒體自噬的功能異常與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān),然而在腦缺血中是否存在線粒體自噬還不明確,闡明其調(diào)控機(jī)制將為進(jìn)一步利用線粒體自噬干預(yù)缺血性腦損傷提供重要依據(jù)。本課題旨在明確缺血性腦損傷過(guò)程中自噬的作用,重點(diǎn)探索該過(guò)程中線粒體自噬的發(fā)生及其對(duì)缺血腦損傷的貢獻(xiàn),并闡明其調(diào)控機(jī)制。第一部分自噬通過(guò)清除損傷線粒體保護(hù)小鼠腦缺血復(fù)灌損傷利用小鼠中動(dòng)脈栓塞(MCAO)后血流復(fù)灌模型模擬腦缺血及其復(fù)灌過(guò)程。我們發(fā)現(xiàn)自噬在短暫性腦缺血(transient MCAO, tMCAO)復(fù)灌中被激活,給予自噬抑制劑3-MA能加重神經(jīng)損傷,而在持續(xù)性腦缺血(permanennt MCAO, pMCAO)損傷中如果手術(shù)前給予3-MA,發(fā)現(xiàn)抑制自噬能夠起到神經(jīng)保護(hù)作用保護(hù)持續(xù)性腦缺血,提示自噬在腦缺血復(fù)灌前后作用不同,本課題首次發(fā)現(xiàn)其在腦缺血復(fù)灌過(guò)程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在小鼠腦缺血復(fù)灌3h后的半暗帶區(qū)域,線粒體被自噬泡所包裹,并且復(fù)灌后線粒體標(biāo)記蛋白TOMM20及COX4I1水平下調(diào)。Real-time PCR結(jié)果表明線粒體DNA編碼基因Atpase 6下調(diào),同樣提示腦缺血復(fù)灌后存在線粒體自噬的現(xiàn)象。3-MA可增加tMCAO所致Cyt C的釋放,提示自噬可能清除了損傷線粒體。通過(guò)線粒體分裂蛋白Drp1抑制劑mdivi-1抑制線粒體自噬,能加重小鼠腦缺血復(fù)灌損傷。進(jìn)一步敲減線粒體自噬的重要蛋白Parkin,亦能加重氧糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation, OGD)所致神經(jīng)元損傷。這些結(jié)果提示清除損傷線粒體可能是自噬在復(fù)灌過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用的主要途徑。上述研究表明線粒體自噬發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用,進(jìn)一步提示促進(jìn)線粒體自噬可能是一種潛在的腦缺血治療新策略。腦缺血過(guò)程伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,后者被證明通過(guò)多條信號(hào)通路激活自噬。因此,本課題研究的第二部分旨在明確腦缺血復(fù)灌過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否可通過(guò)增強(qiáng)線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分適度誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)選擇性促進(jìn)線粒體自噬發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用小鼠MCAO復(fù)灌即刻側(cè)腦室給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑3μg tunicamycin (TM)和20 ng thapsigargin (TG),可顯著減少24 h后腦梗死體積,緩解腦缺血引起的葡萄糖代謝降低并改善神經(jīng)行為學(xué)癥狀。此外,TM和TG在OGD處理的原代培養(yǎng)神經(jīng)元中同樣發(fā)揮保護(hù)作用,并能被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA逆轉(zhuǎn)。TM和TG可劑量依賴地抑制OGD所致線粒體依賴的細(xì)胞凋亡。有意思的是,TM及TG均能在不影響自噬流的情況下進(jìn)一步選擇性加強(qiáng)線粒體自噬,促進(jìn)缺血復(fù)灌后Parkin被招募至線粒體上。為明確線粒體自噬介導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的上述保護(hù)作用,通過(guò)藥理學(xué)和基因沉默手段阻斷線粒體自噬(3-MA.Mdivi-1、ATG7 knockdown),發(fā)現(xiàn)可顯著逆轉(zhuǎn)TM和TG的保護(hù)作用。進(jìn)一步對(duì)EIF2S1,ATF4,Parkin分別進(jìn)行基因沉默,均能抑制線粒體自噬,逆轉(zhuǎn)TM和TG的保護(hù)作用。利用Parkin敲除雜合子小鼠(Parki+/-)發(fā)現(xiàn),TM的保護(hù)作用同樣消失。以上結(jié)果表明,TM和TG可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路PERK/EIF2S1/ATF4調(diào)控Parkin蛋白表達(dá)上調(diào),促進(jìn)其向線粒體轉(zhuǎn)位并選擇性上調(diào)線粒體自噬,最終通過(guò)清除損傷線粒體發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用。線粒體自噬發(fā)生及調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚,本研究發(fā)現(xiàn)Parkin是腦缺血過(guò)程中重要的線粒體自噬調(diào)控因素。然而腦缺血中Parkin蛋白表達(dá)水平隨著復(fù)灌時(shí)間延長(zhǎng)而快速下降,而同時(shí)線粒體自噬仍舊維持在一個(gè)較高的水平,提示還有其它線粒體自噬的途徑存在。Nix是一種線粒體外膜蛋白,被認(rèn)為是一種重要的線粒體自噬受體,其對(duì)于紅細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的線粒體自噬起到關(guān)鍵作用。本課題進(jìn)一步探討了Nix介導(dǎo)的線粒體自噬在腦缺血復(fù)灌中的保護(hù)作用。第三部分Nix通過(guò)非Parkin依賴途徑調(diào)控線粒體自噬保護(hù)缺血復(fù)灌腦損傷為明確Nix是否參與腦缺血復(fù)灌過(guò)程中的線粒體自噬,我們利用Nix+/+,Nix-/-,Nix-/-三種小鼠進(jìn)行MCAO手術(shù),于缺血后復(fù)灌6h后檢測(cè)缺血腦組織線粒體膜蛋白TOMM20和COX411水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nix敲除抑制缺血復(fù)灌引起的線粒體自噬,給予GFP-Nix腺相關(guān)病毒(GFP_Nix AAVs)可以逆轉(zhuǎn)Nix敲除引起的線粒體自噬障礙,同時(shí)也逆轉(zhuǎn)了Nix敲除引起的腦梗死增加。提示Nix參與了腦缺血復(fù)灌后的線粒體自噬并發(fā)揮保護(hù)作用。為探討Nix介導(dǎo)的線粒體自噬在此過(guò)程中是否依賴于經(jīng)典的Parkin途徑,本課題在Parkin-/-小鼠腦內(nèi)給予GFP_Nix AAVs,發(fā)現(xiàn)Nix高表達(dá)后仍能逆轉(zhuǎn)Parkin敲除引起的線粒體自噬障礙并同樣抑制其腦梗死體積增加。利用野生型小鼠,Nix-/-小鼠,Parkin-/-小鼠,Nix和Parkin共同敲除的小鼠(Nix-/- Parkin-/-, DKO),我們發(fā)現(xiàn)相較于Nix-／-或Parkin-/-小鼠,DKO小鼠的線粒體自噬水平顯著降低,反映在線粒體膜蛋白TOMM20和COX4I1的下降,以及自噬標(biāo)志蛋白LC3在線粒體上的比例減少,上述結(jié)果均表明了Nix是通過(guò)Parkin非依賴途徑介導(dǎo)的腦缺血復(fù)灌過(guò)程中的線粒體自噬,提示Nix可能是干預(yù)缺血性腦損傷的潛在藥物靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743

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本文編號(hào)：2568155