【摘要】：【研究背景】缺血性腦卒中(Cerebral ischemia stroke),是神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的急重癥之一,是指各種腦血管先天發(fā)育異常以及后天因素(高血壓、高脂血癥、糖尿病等)引起的腦血管管腔狹窄、閉塞或堵塞,從而導(dǎo)致局部或全腦腦血流灌注銳減或中斷而引發(fā)的一種疾病。缺血性腦卒中其發(fā)病率、致殘率及致死率均高,嚴(yán)重威脅我國人民健康及生活質(zhì)量。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,缺血再灌注治療(包括急性溶栓、介入取栓或支架置入及血管搭橋等)在臨床得到廣泛應(yīng)用,也取得較好的療效。然而,在獲得缺血再灌注治療益處的同時(shí),其也可引起明顯的腦缺血再灌注損傷,嚴(yán)重影響治療效果。研究發(fā)現(xiàn),多種致傷機(jī)制均參與其中,如鈣超載、興奮性毒性、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。已有大量研究旨在闡明腦缺血再灌注損傷的致傷機(jī)制及尋找其潛在的干預(yù)靶點(diǎn),然而,目前情形并不容樂觀。容量性鈣內(nèi)流(Capacity calcium entry,CCE)是細(xì)胞內(nèi)鈣動態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,通過感應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣濃度,調(diào)控CCE復(fù)合體形成,介導(dǎo)外鈣內(nèi)流,補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)及鈣庫內(nèi)鈣。CCE復(fù)合體主要由鈣濃度感應(yīng)分子——基質(zhì)相互作用分子(Stromal interaction molecule,STIM)、鈣釋放激活的鈣通道(Ca~(2+)release-activated Ca~(2+)channels,CRACs)及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成。氧化應(yīng)激、鈣庫排空及細(xì)胞酸化等因素可激活CCE,形成CCE復(fù)合體,調(diào)控神經(jīng)元存活,參與急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。如前所述,氧化應(yīng)激、鈣超載等均參與腦缺血再灌注損傷,那么CCE是否在其中發(fā)揮作用,及其具體機(jī)制如何,目前尚不可知�！狙芯磕康摹勘狙芯恐荚�:(1)明確腦缺血再灌注損傷中,CCE主要構(gòu)成分子時(shí)空變化規(guī)律及其作用;(2)探討調(diào)控CCE所介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制;(3)尋找潛在的CCE內(nèi)源性調(diào)控分子,為腦缺血再灌注損傷治療提供新的思路或潛在的干預(yù)靶點(diǎn)�！狙芯糠椒ā�1、采用原代海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivationreperfusion,OGD/Rep.)模型體外模擬腦缺血再灌注損傷;采用谷氨酸誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞系氧化應(yīng)激模型研究Homer1a與CCE間相互作用關(guān)系;2、采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測OGD/Rep.處理后CCE構(gòu)成分子、凋亡及自噬相關(guān)分子的mRNA及蛋白水平改變;3、采用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放量檢測評價(jià)神經(jīng)元損傷情況,采用原位末端標(biāo)記(Terminal dUTP nick end labelling,TUNEL)方法檢測神經(jīng)元凋亡改變;4、采用轉(zhuǎn)染STIM1、STIM2及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等熒光蛋白標(biāo)記質(zhì)粒及免疫熒光染色技術(shù)可視化CCE構(gòu)成分子空間定位變化;5、采用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)及CRISPR/Cas9技術(shù)調(diào)控神經(jīng)元STIM1、STIM2及Homer1a表達(dá)水平;6、采用轉(zhuǎn)染LC3-GFP及mRFP-GFP-LC3熒光蛋白標(biāo)記質(zhì)�？梢暬窠�(jīng)元自噬及自噬流改變;7、采用CCE、鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶II(Calmodulin-Dependent Protein Kinase II,CaMKII)及自噬藥物抑制劑或激動劑調(diào)控其活性;8、采用Fluo-4 AM、Fura-red AM及胞漿鈣熒光指示蛋白監(jiān)測CCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流及胞漿內(nèi)鈣水平改變;9、采用蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)技術(shù)檢測蛋白分子間相互作用�！狙芯拷Y(jié)果】第一部分研究發(fā)現(xiàn):OGD/Rep.處理后,CCE主要構(gòu)成分子,包括STIM1、STIM2、Orai1、Orai2及TRPC1 mRNA及蛋白水平均無明顯改變,然而,胞漿內(nèi)STIM1斑塊數(shù)明顯增加;抑制CCE可明顯減輕OGD/Rep.引起的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣超載;下調(diào)或敲除STIM1表達(dá)或應(yīng)用CCE藥物抑制劑均可明顯減輕OGD/Rep.誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,抑制其凋亡,促進(jìn)神經(jīng)元存活。本部分研究表明,CCE參與OGD/Rep.介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的致傷機(jī)制,抑制CCE可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分研究發(fā)現(xiàn):OGD/Rep.處理后,神經(jīng)元自噬水平增加,但同時(shí)也存在一定程度的自噬降解受阻;藥物激動劑激活自噬可減輕OGD/Rep.介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷;CCE抑制可發(fā)揮類似自噬激動劑的作用,在激活神經(jīng)元自噬的同時(shí),并一定程度改善自噬降解受阻;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),OGD/Rep.處理后,CaMKII磷酸化水平明顯增加,而抑制CaMKII活性可明顯下調(diào)雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)磷酸化水平,促進(jìn)自噬激活,減輕神經(jīng)元損傷;抑制CCE后,CaMKII及mTOR磷酸化水平均明顯下降,且CCE抑制及mTOR抑制所介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用并無明顯疊加效應(yīng)。本部分研究表明,抑制CCE可一方面通過抑制CaMKII-mTOR信號,促進(jìn)自噬形成,同時(shí)另一方面也可改善自噬降解受阻,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。第三部分研究旨在尋找CCE潛在的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控分子,為排除離子型谷氨酸受體的影響,特采用谷氨酸誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞系氧化應(yīng)激模型,研究發(fā)現(xiàn):氧化應(yīng)激損傷后,STIM1及Orai1蛋白水平無明顯改變,而STIM1胞漿內(nèi)斑塊數(shù)明顯增加,并逐漸向細(xì)胞膜靠近;下調(diào)或敲除STIM1表達(dá)或采用CCE藥物抑制劑均可減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷;上調(diào)Homer1a表達(dá)則可明顯抑制CCE所介導(dǎo)的鈣內(nèi)流、氧化應(yīng)激所引起的晚期細(xì)胞內(nèi)鈣超載及線粒體氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮類似CCE抑制所介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用;此外,co-IP發(fā)現(xiàn)STIM1、Homer1a及Orai1間存在明顯蛋白相互作用,上調(diào)Homer1a蛋白表達(dá)可明顯抑制谷氨酸引起的STIM1-Orai1復(fù)合體形成。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抑制CCE可減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷,而Homer1a可通過抑制STIM1-Orai1復(fù)合體形成負(fù)性調(diào)控CCE,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用�！狙芯拷Y(jié)論】本研究首先證實(shí),CCE參與腦缺血再灌注損傷的致傷機(jī)制,抑制CCE可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;該神經(jīng)保護(hù)作用其機(jī)制可能與促進(jìn)自噬發(fā)生、改善自噬降解障礙及抑制凋亡有關(guān);此外,本研究還發(fā)現(xiàn)一種CCE內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控分子——Homer1a,其可通過負(fù)性競爭抑制STIM1-Orai1復(fù)合體形成,抑制CCE,介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究進(jìn)一步揭示了腦缺血再灌注損傷的致傷機(jī)制,也發(fā)現(xiàn)了該致傷機(jī)制的內(nèi)源性調(diào)控分子,為缺血性腦卒中的治療提供了新的切入點(diǎn)及干預(yù)靶點(diǎn)。
【圖文】：

一、缺血性腦卒中研究現(xiàn)狀1、腦卒中流行病學(xué)及分類腦卒中，即腦血管意外（俗稱腦中風(fēng)），是神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的急重癥之一，是指各種腦血管先天發(fā)育異常以及后天因素（高血壓、高脂血癥、糖尿病等）引起的腦血管管壁破裂或者管腔狹窄、閉塞或堵塞，從而導(dǎo)致局部或全腦腦血流灌注銳減或中斷而引發(fā)的一組疾病，主要表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺失。其發(fā)病率高，達(dá) 258/10 萬人，致殘、致死率也均較高，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腦卒中是 60 歲以上老人的第二大死因，是15-59 歲人民的第五大死因[1]。而在我國，據(jù) Circulation 報(bào)道，年齡標(biāo)準(zhǔn)化流行率、發(fā)病率和死亡率為 1114.8/10 萬人，246.8 和 114.8/10 萬人/年（圖 1-1），已成我國人民的頭號死因及成人首要致殘?jiān)騕3, 4]。

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文種被動死亡方式。然而，近些年研究表明壞死并非僅僅如此，在發(fā)現(xiàn) Caspase 非依賴的細(xì)胞死亡，，表現(xiàn)出細(xì)胞壞死的特征性改變。是程序化的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果。2005 年，Yuan 等人的將其命凋亡樣壞死。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自殺的一個(gè)過程，包括細(xì)胞皺縮、A 片段化及凋亡小體形成等等。生化水平上，凋亡特征性表現(xiàn)為磷 Caspase 激活。研究提示，缺血性腦卒中延遲性細(xì)胞死亡主要為細(xì)一動態(tài)調(diào)節(jié)的過程，有助于清除氧化蛋白、脂質(zhì)及受損細(xì)胞器，噬小體形成，然而其在缺血性腦卒中中的作用目前爭議較大[11]。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3


本文編號：2565964