發(fā)布時間：2019-11-05 16:50

【摘要】：研究背景 帕金森病是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要特點是紋狀體區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元的持續(xù)丟失。目前,對帕金森病得主要治療方法是多巴胺替代治療。然而,這種替代治療只是在初期有效,隨著疾病的進展,有效性會逐漸下降,并且會產(chǎn)生運動系統(tǒng)的并發(fā)癥。因此,替換治療是很必需的。具有自我更新和向其他細胞分化功能的干細胞可能會為帕金森病的治療提供一種方法。從胚胎干細胞、誘導型多能干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞獲得多巴胺能神經(jīng)元有技術(shù)和倫理上的限制。而成人外周血來源的多能干細胞(peripheral blood insulin-producing cells, PB-IPC)能克服以上困難。本研究將分離、培養(yǎng)好的PB-IPC移植入帕金森大鼠模型的黑質(zhì)致密部(SNC)和紋狀體(CPU),并對其分化和療效情況進行初步觀察。 研究方法 1.外周血來源的多能干細胞的制備 采集健康志愿者的外周血,加入淋巴細胞分離液分離單個核細胞,加入紅細胞分離液分離紅細胞。分離出單個核細胞,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。 2.實時定量PCR 采用實時定量PCR檢測胚胎干細胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。使用Qiagenkit提取細胞總RNA,根據(jù)Applied Biosystems公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將說明書將總RNA合成為單鏈cDNA。以ABI Prism7300HT Fast Real-Time PCR System進行實時定量PCR檢測,反應(yīng)體系如下：50℃,2分鐘；95℃,2分鐘；65℃,60s×40個循環(huán)。結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參。 3.帕金森大鼠模型的制備 將6-OHDA定向注射到大鼠的MFB和SNC,并皮下注射阿撲嗎啡鑒定帕金森動物模型是否制作成功。 4.旋轉(zhuǎn)行為學的測定 術(shù)后第三周開始觀察行為學變化,阿樸嗎啡(APO)腹腔注射(0.5mg/kg)。若大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè),且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)210r/30min,則視為PD大鼠模型制備成功。移植后分別在2周、4周、6周、8周,觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為學的改變。 5.免疫熒光染色 PB-IPC移植后8周時,每組各取3只大鼠行心臟灌流固定取腦,30%蔗糖脫水后制作20um冰凍切片。每只大鼠取移植位點附近腦組織斷面切片2張,0.5%Triton作用15分鐘,山羊血清封閉20分鐘后,加入TH—抗(1：800)、DAT—抗(1：400),置于濕盒內(nèi)4℃過夜；第二天PBS洗3次后加入相應(yīng)熒光二抗。 6.ELISA檢測 以預(yù)冷的PBS(0.02mol/L, pH7.0-7.2)充分沖洗待測的組織塊,稱取組織塊的重量。以1：9的比例(即1g組織塊：9ml PBS)做成10%的腦組織勻漿,于4℃5000r/min,離心15min,取上清,采用ELISA法測上清液中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量。 研究結(jié)果 1. PB-IPC表現(xiàn)出類似臍帶血多能干細胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形態(tài)和生長特點 PB-IPC表現(xiàn)出類似臍帶血多能干細胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形態(tài)和生長特點：圓形或橢圓形,貼壁生長、擴增 2. PB-IPC表達胚胎干細胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 PB-IPC表達胚胎干細胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄因子Ngn1、Ngn2和Mashl; 3. PB-IPC移植后,實驗組的旋轉(zhuǎn)行為學有明顯改善 術(shù)后第2、4、6、8周計算PB-IPC移植組PD大鼠在阿撲嗎啡誘導后30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),較術(shù)前分別減少了(26±2)%、(34±4)%、(39±7)%和(37±5)%,而對照組無明顯改變,各觀察點結(jié)果同對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P0.05) 4.移植入PD大鼠的PB-IPC分化為成熟的多巴胺能神經(jīng)元 移植后8周,可見移植入PD大鼠Brdu陽性的PB-PC(80±3.41)%表達TH,(754±7.07)%表達DAT,對照組PD大鼠的腦組織切片沒有Brdu、TH和DAT表達陽性的細胞存在。 5.移植的PB-IPC具有釋放多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的功能 通過ELISA實驗數(shù)據(jù)分析,移植組上清液中多巴胺含量大約為(1954.12±14.79)pg/g,對照組上清液的多巴胺含量大約為(1687.94±14.82)pg/g。移植組的多巴胺含量明顯高于對照組,P0.05。 結(jié)論 1.PB-IPC表達胚胎干細胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄因子Ngnl、Ngn2和Mash1 2. PB-IPC移植入PD大鼠后,能分化為成熟的多巴胺能神經(jīng)元,能有效治療PD模型大鼠。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙卿;高俊鵬;李文偉;蔡定芳;;前凋亡分子CHOP/GADD153的生物學特性及其在帕金森病發(fā)病中的意義[J];國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志;2009年05期

2 劉衛(wèi)鵬;王君;屈素清;杜侃;楊輝;楊印祥;汪兆艷;欒佐;;人神經(jīng)前體細胞移植治療兒童廣泛性發(fā)育障礙初探[J];中國當代兒科雜志;2013年10期

3 Xiao-Bing Zhang;;Cellular Reprogramming of Human Peripheral Blood Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

4 李玲玲;孫藝學;王愛兵;李子義;張學明;;人α-突觸核蛋白A30P突變對小鼠成體大腦吻端遷移流中神經(jīng)發(fā)生的抑制作用及其機制[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2013年06期

5 陳琳;彭芳;郁可;林杭;王慶松;;α-突觸核蛋白與帕金森病關(guān)系的研究進展[J];廣東醫(yī)學;2013年23期

6 張君度;龍大宏;陳艷;劉菲菲;;膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導神經(jīng)干細胞分化過程中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達變化[J];解剖學研究;2013年06期

7 楊軍政;李永海;李萌;林俊堂;;臍帶血間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞誘導分化及應(yīng)用[J];重慶醫(yī)學;2014年03期

8 呂鐵偉;孫慧超;張蕾;劉玲娟;吳曉云;劉曉燕;朱靜;劉振國;田杰;;ox-LDL抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外增殖和Oct-4表達[J];重慶醫(yī)學;2014年14期

9 晏振;吳林;薛丹丹;高先琦;陳文芳;;人參皂苷Rg1和IGF-Ⅰ對帕金森病小鼠DA能神經(jīng)元作用[J];青島大學醫(yī)學院學報;2014年04期

10 屠建棋;楊欣欣;竇珊珊;程葆華;徐旭東;;小膠質(zhì)細胞與帕金森病[J];華西醫(yī)學;2010年05期

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 馬芹穎;快速老化小鼠SAMP8老化過程中自噬的改變以及mTOR信號通路功能研究[D];河北醫(yī)科大學;2011年

2 鄭慧芬;自噬在系統(tǒng)性炎癥所致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用及機制研究[D];蘇州大學;2013年

3 朱天琦;GDNF和NT-3雙基因誘導BMSCs分化為神經(jīng)樣細胞的實驗研究[D];華中科技大學;2013年

4 魯珊珊;磁粒子標記骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)動脈移植治療犬腦梗死的MR成像研究[D];南京醫(yī)科大學;2013年

5 王喜梅;Sitagliptin對缺氧環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞的保護作用及相關(guān)機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

6 孔濱;RNA干擾GCase對α-突觸核蛋白的影響及其機制的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2013年

7 裴志勇;地黃低聚糖對同種異體脂肪組織來源干細胞移植治療小型豬急性心肌梗死效應(yīng)及機制的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2011年

8 袁盈;“顱底七穴”治療帕金森病的臨床療效評價研究[D];中國中醫(yī)科學院;2013年

9 張嵬;hUC-MSC_S/hHGF基因修飾的hUC-MSC_S移植在心肌損傷修復中的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2013年

10 龍乾發(fā);Hes1基因沉默的骨髓間充質(zhì)干細胞對癲癇的治療作用[D];第四軍醫(yī)大學;2013年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 鄧華明;蛇床子素對LPS誘導的小膠質(zhì)細胞活化的影響[D];暨南大學;2011年

2 劉洋;線粒體解耦聯(lián)蛋白2與帕金森病的相關(guān)性[D];南京醫(yī)科大學;2011年

3 郭文瓊;肝臟X受體通過抑制中腦炎癥保護小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2011年

4 常靜;Kir6.2基因敲除對MPTP急性神經(jīng)毒性的影響[D];南京醫(yī)科大學;2008年

5 張國鋒;小膠質(zhì)細胞對次聲損傷的反應(yīng)變化及對原代培養(yǎng)神經(jīng)元的影響[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

6 丁方香;深部腦刺激在探究束旁核和內(nèi)側(cè)蒼白球的聯(lián)系中的應(yīng)用[D];山東師范大學;2013年

7 余列;骨髓單個核細胞移植對腦梗死大鼠新血管形成的影響[D];鄭州大學;2013年

8 陸樂;自主運動對小鼠學習記憶及海馬神經(jīng)發(fā)生的影響[D];華東師范大學;2013年

9 魏建強;不同途徑移植骨髓間充質(zhì)干細胞促進創(chuàng)傷性腦損傷大鼠功能恢復和神經(jīng)再生的研究[D];河北醫(yī)科大學;2013年

10 吳元楨;新生樹，

本文編號：2556254