【摘要】：研究背景 帕金森病是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要特點(diǎn)是紋狀體區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元的持續(xù)丟失。目前,對(duì)帕金森病得主要治療方法是多巴胺替代治療。然而,這種替代治療只是在初期有效,隨著疾病的進(jìn)展,有效性會(huì)逐漸下降,并且會(huì)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的并發(fā)癥。因此,替換治療是很必需的。具有自我更新和向其他細(xì)胞分化功能的干細(xì)胞可能會(huì)為帕金森病的治療提供一種方法。從胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得多巴胺能神經(jīng)元有技術(shù)和倫理上的限制。而成人外周血來源的多能干細(xì)胞(peripheral blood insulin-producing cells, PB-IPC)能克服以上困難。本研究將分離、培養(yǎng)好的PB-IPC移植入帕金森大鼠模型的黑質(zhì)致密部(SNC)和紋狀體(CPU),并對(duì)其分化和療效情況進(jìn)行初步觀察。 研究方法 1.外周血來源的多能干細(xì)胞的制備 采集健康志愿者的外周血,加入淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞,加入紅細(xì)胞分離液分離紅細(xì)胞。分離出單個(gè)核細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。 2.實(shí)時(shí)定量PCR 采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胚胎干細(xì)胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。使用Qiagenkit提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)Applied Biosystems公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將說明書將總RNA合成為單鏈cDNA。以ABI Prism7300HT Fast Real-Time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),反應(yīng)體系如下：50℃,2分鐘；95℃,2分鐘；65℃,60s×40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參。 3.帕金森大鼠模型的制備 將6-OHDA定向注射到大鼠的MFB和SNC,并皮下注射阿撲嗎啡鑒定帕金森動(dòng)物模型是否制作成功。 4.旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的測(cè)定 術(shù)后第三周開始觀察行為學(xué)變化,阿樸嗎啡(APO)腹腔注射(0.5mg/kg)。若大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè),且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)210r/30min,則視為PD大鼠模型制備成功。移植后分別在2周、4周、6周、8周,觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的改變。 5.免疫熒光染色 PB-IPC移植后8周時(shí),每組各取3只大鼠行心臟灌流固定取腦,30%蔗糖脫水后制作20um冰凍切片。每只大鼠取移植位點(diǎn)附近腦組織斷面切片2張,0.5%Triton作用15分鐘,山羊血清封閉20分鐘后,加入TH—抗(1：800)、DAT—抗(1：400),置于濕盒內(nèi)4℃過夜；第二天PBS洗3次后加入相應(yīng)熒光二抗。 6.ELISA檢測(cè) 以預(yù)冷的PBS(0.02mol/L, pH7.0-7.2)充分沖洗待測(cè)的組織塊,稱取組織塊的重量。以1：9的比例(即1g組織塊：9ml PBS)做成10%的腦組織勻漿,于4℃5000r/min,離心15min,取上清,采用ELISA法測(cè)上清液中多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量。 研究結(jié)果 1. PB-IPC表現(xiàn)出類似臍帶血多能干細(xì)胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn) PB-IPC表現(xiàn)出類似臍帶血多能干細(xì)胞(Cord blood-derived multipotent stem cells, CB-SCs)的形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)：圓形或橢圓形,貼壁生長(zhǎng)、擴(kuò)增 2. PB-IPC表達(dá)胚胎干細(xì)胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 PB-IPC表達(dá)胚胎干細(xì)胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄因子Ngn1、Ngn2和Mashl; 3. PB-IPC移植后,實(shí)驗(yàn)組的旋轉(zhuǎn)行為學(xué)有明顯改善 術(shù)后第2、4、6、8周計(jì)算PB-IPC移植組PD大鼠在阿撲嗎啡誘導(dǎo)后30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),較術(shù)前分別減少了(26±2)%、(34±4)%、(39±7)%和(37±5)%,而對(duì)照組無明顯改變,各觀察點(diǎn)結(jié)果同對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) 4.移植入PD大鼠的PB-IPC分化為成熟的多巴胺能神經(jīng)元 移植后8周,可見移植入PD大鼠Brdu陽(yáng)性的PB-PC(80±3.41)%表達(dá)TH,(754±7.07)%表達(dá)DAT,對(duì)照組PD大鼠的腦組織切片沒有Brdu、TH和DAT表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞存在。 5.移植的PB-IPC具有釋放多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的功能 通過ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,移植組上清液中多巴胺含量大約為(1954.12±14.79)pg/g,對(duì)照組上清液的多巴胺含量大約為(1687.94±14.82)pg/g。移植組的多巴胺含量明顯高于對(duì)照組,P0.05。 結(jié)論 1.PB-IPC表達(dá)胚胎干細(xì)胞多向分化潛能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Klf4、Nanog、Sox2,以及促神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄因子Ngnl、Ngn2和Mash1 2. PB-IPC移植入PD大鼠后,能分化為成熟的多巴胺能神經(jīng)元,能有效治療PD模型大鼠。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2556254