發(fā)布時間：2019-10-11 14:42

【摘要】：【研究背景】充足的腦血流量對于維持大腦功能正常運轉至關重要,慢性腦低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)表現(xiàn)為腦血流量持續(xù)減少,作為多種腦血管疾病發(fā)展的共同病理過程,可導致認知功能減退。然而,CCH致認知功能障礙發(fā)病機理不完全清楚,尚無特效藥物和治療手段,因此,積極尋找預防、治療策略是臨床亟待解決的重要課題。研究發(fā)現(xiàn),CCH致認知功能障礙的機制復雜,主要的病理過程包括缺血導致細胞能量缺失、腦白質損傷、神經(jīng)發(fā)生受損、血腦屏障破壞、脂質代謝和神經(jīng)血管單元功能紊亂、細胞壞死和凋亡等。神經(jīng)元作為CNS中最小的功能單元,一定數(shù)量及功能正常的神經(jīng)元是學習記憶的基礎。CCH中,神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡、壞死等一系列的病理生理學變化,進而導致大腦高級神經(jīng)功能損傷,如運動功能損傷、認知能力下降等。CCH致神經(jīng)元損傷,前額葉皮層(Prefrontal cortex,PFC)和海馬(Hippocampus,Hipp)是最受關注的腦區(qū),被認為是CCH后認知功能受損害的形態(tài)學基礎。PFC和Hipp是參與空間學習記憶的中樞腦區(qū),PFC和Hipp對缺血缺氧十分敏感,長期缺血導致該部位神經(jīng)元功能和結構的損害;其結構異常與學習記憶能力等行為學改變關系密切,進而引起學習記憶能力的下降,甚至癡呆。因此,研發(fā)可促進腦缺血后PFC和Hipp區(qū)神經(jīng)元存活的措施,如神經(jīng)保護劑,對認知功能障礙的治療具有重要意義。祖國醫(yī)學一直致力于研究、開發(fā)用于CCH預防、治療的藥物,其中人參(Radix Ginseng)為常用的經(jīng)典藥物之一。人參隸屬于五加科(Araliaceae),常用作功能性保健食品的替代或補充用藥,亦用于抗癌、抗糖尿病和抗炎治療;同時,人參具有良好的神經(jīng)保護作用。人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd,GSRd)是人參中的主要活性成分之一,大量研究證實,GSRd保護腦缺血及神經(jīng)退行性病變模型中的神經(jīng)元、改善動物的空間學習能力并預防記憶喪失,但其基本的機制仍然未知。近期研究證實,人參皂苷的神經(jīng)保護作用與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)的生成關系密切。BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白,在神經(jīng)可塑性、神經(jīng)元再生和細胞存活中起關鍵作用,常于缺氧或缺血后釋放以保護腦免受損傷。臨床常用藥物能夠發(fā)揮增強記憶、神經(jīng)保護作用等,部分得益于促進或提高BDNF的表達。然而,人參皂苷是如何調控BDNF、它是否可通過BDNF發(fā)揮神經(jīng)保護作用目前尚不清楚。多種機制參與調控BDNF的表達,其中表觀遺傳學修飾機制因是多種分子的共同上游調控機制而備受關注。表觀遺傳學修飾機制包含組蛋白的乙�；揎�、DNA的甲基化修飾、非編碼RNA調控和染色質重塑等,影響基因表達、調節(jié)細胞周期等。其中,組蛋白乙�；{控被證實參與動物學習記憶活動的形成和維持。組蛋白乙�；癁橐环N高度動態(tài)的調節(jié)過程,主要在兩類酶,即組蛋白去乙�；�(Histone deacetylase,HDAC)和組蛋白乙酰轉移酶(Histone acetyltransferase,HAT)的作用下實現(xiàn)。一般情況下,HDAC抑制基因的表達,而HAT促進基因的表達。因此,本課題擬在小鼠CCH模型中,探討GSRd是否可通過改變組蛋白乙�；揎�,調控BDNF表達,從而發(fā)揮對PFC和Hipp區(qū)神經(jīng)元的保護作用�！狙芯磕康摹恳訡CH小鼠為研究對象,探討GSRd通過增加BDNF的生成,提高神經(jīng)元存活,用于治療CCH致認知功能障礙的分子機制。進一步,通過體外細胞培養(yǎng)體系模擬CCH病理狀態(tài),闡明組蛋白乙�；揎椪{控GSRd介導的BDNF生成過程、參與GSRd促神經(jīng)元存活,從而改善CCH引起的學習記憶障礙的分子機制,為臨床治療CCH造成的認識功能障礙提供新思路和可能的治療手段�！狙芯糠椒ā�1.微彈簧圈法造成雙側頸動脈狹窄(Bilateral Carotid Artery stenosis,BCAS)建立CCH小鼠模型;Morris水迷宮行為學評價CCH是否導致小鼠學習記憶功能障礙,進而給予GSRd治療21 d,是否可改善CCH導致的小鼠學習記憶障礙。2.蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色觀察,給予或不給予GSRd治療CCH小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)、存活率變化;采用Western blot方法,檢測CCH模型小鼠腦內凋亡信號Caspase-3蛋白表達的變化,并觀察給予GSRd治療后是否逆轉這些蛋白的表達。3.實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測各組小鼠海馬中BDNF的表達變化,探討GSRd神經(jīng)保護作用可能的機制。4.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,建立氧糖剝奪模型(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模擬CCH模型,采用噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium bromide,MTT)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)檢測細胞活力、流式細胞技術(Flow Cytometry,FCM)檢測神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象,以及給予不同濃度梯度GSRd時神經(jīng)元存活率的變化;采用Western blot方法,檢測細胞內凋亡信號Caspase-3蛋白表達的變化,評估體外GSRd的神經(jīng)保護能力。5.采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,q PCR、ELISA法,觀察不同濃度梯度GSRd對BDNF表達量的影響。6.采用Western blot方法,檢測給予或不給予GSRd治療后,CCH小鼠腦中p300/CBP結合蛋白(CREB binding proteins,CBP)、組蛋白H3乙酰化(Acetylated Histone H3,Ac-H3)、組蛋白去乙�；�2(histone deacetylase 2,HDAC2)表達水平的變化,旨在探究BDNF表達調控的上游表觀遺傳修飾機制。7.體外采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,進一步確認GSRd對Ac-H3、HDAC2表達水平變化的影響,分析對BDNF表達的上游調控機制。8.采用染色質免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)方法,觀察GSRd介導的BDNF表達增加是否通過促進Ac-H3與BDNF啟動子IV區(qū)域的結合,或降低HDAC與BDNF啟動子IV區(qū)域的結合實現(xiàn);進一步,預先給予HDAC的抑制劑MS-275,觀察是否可增強該效應,進而最終影響B(tài)DNF的表達�！狙芯拷Y果】1.Morris水迷宮結果顯示,與假手術組相比,CCH導致小鼠學習記憶障礙,表現(xiàn)為小鼠搜索平臺時間(潛伏期)延長,目標象限游泳距離百分比降低,穿越平臺次數(shù)減少(P?0.01);與模型組相比,GSRd治療后,顯著改善CCH導致的小鼠空間學習記憶障礙(P0.05或P0.01)。2.HE染色結果證實,與假手術組相比,CCH模型小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元的結構不清晰,出現(xiàn)細胞核固縮和大量細胞凋亡(P0.01);與CCH模型組相比,給予GSRd治療后神經(jīng)元的形態(tài)結構與正常相似,細胞凋亡的比例下降(P0.01);Western blot方法CCH小鼠腦內凋亡信號Caspase-3蛋白表達增加,給予GSRd治療后降低Cleaved Caspase-3的表達(P0.05或P0.01)。3.q PCR、ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),與假手術組相比,CCH小鼠海馬中BDNF的m RNA和蛋白表達水平顯著下降(P0.01);與模型組相比,GSRd治療后BDNF的表達可恢復至近正常水平。4.MTT、LDH、FCM結果顯示,培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)OGD損傷后,神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡,存活率顯著下降(P0.01),不同濃度GSRd處理則能提高細胞存活(P0.05或P0.01);同時,GSRd處理能夠降低OGD條件下凋亡信號Caspase-3蛋白的高表達(P0.05或P0.01),提示GSRd的體外亦具有神經(jīng)保護作用。5.與體內結果一致,采用體外培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,亦觀察并確認不同濃度GSRd處理后,BDNF表達量增加(P0.05或P0.01),提示體外GSRd的神經(jīng)保護作用可能通過增加BDNF的表達實現(xiàn)。6.Western blot方法分析BDNF表達調控的上游組蛋白修飾機制,結果顯示,CCH損傷后,與假手術組相比,小鼠腦中p300/CBP、Ac-H3水平顯著下降(P0.01),而HDAC2表達水平升高(P0.01);給予GSRd治療后,則能逆轉這些調控BDNF表達的上游蛋白的異常表達(P0.01)。7.進一步采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型,確認BDNF表達調控的上游組蛋白修飾機制,結果顯示,與對照組相比,OGD/R組神經(jīng)元Ac-H3表達水平顯著下降(P0.01),而HDAC2表達水平顯著上升(P0.01);GSRd處理后則可逆轉這些上游蛋白的異常表達(P0.01)。8.Ch IP法結果顯示,OGD損傷促進HDAC2與BDNF啟動子IV區(qū)域的結合,而降低Ac-H3與BDNF啟動子IV區(qū)域的結合,導致BDNF的表達顯著降低;給予GSRd處理后則可促進Ac-H3、降低HDAC與BDNF啟動子IV區(qū)域的結合,使BDNF的表達恢復正常;進一步研究發(fā)現(xiàn),預先給予HDAC的抑制劑MS-275,則可增強GSRd介導的該效應。該結果提示,OGD損傷條件下,BDNF的表達受到組蛋白修飾的調節(jié)�！狙芯拷Y論】1.GSRd改善CCH導致的學習記憶障礙,并減輕CCH小鼠PFC和Hipp神經(jīng)元的凋亡,該效應與CCH小鼠腦內BDNF表達增加相關;BDNF的表達受到P300/CBP、Ac-H3和HDAC2參與的組蛋白乙�；恼{節(jié)。故GSRd通過表觀遺傳學調控BDNF的表達,保護CCH時神經(jīng)元免受損傷,從而改善空間記憶能力。2.體外研究證實,暴露于OGD/R導致神經(jīng)元活力喪失,GSRd則對培養(yǎng)神經(jīng)元起到神經(jīng)保護作用。GSRd通過上調BDNF的表達,降低了OGD/R誘導的細胞活力喪失和LDH釋放,這與形態(tài)分析和凋亡的Caspase-3指標一致。OGD/R處理足以增加HDAC2、減少Ac-H3,同時伴隨BDNF表達的下降;GSRd處理可逆轉上述種種變化,提示GSRd可能通過重建Ac-H3與HDAC2之間的平衡,參與BDNF轉錄調節(jié),促進神經(jīng)元存活。3.BDNF啟動子IV區(qū)域受到組蛋白修飾機制的調控,作為HDAC的抑制劑——MS-275,與GSRd之間具有協(xié)同作用。上述結果提示,在CCH小鼠模型中,GSRd提供神經(jīng)保護作用可能是通過組蛋白乙�；揎棛C制對BDNF進行調控而實現(xiàn)的,從而揭示了GSRd神經(jīng)保護的潛在分子機制。盡管我們并不排除GSRd可能通過其他途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用,但本研究發(fā)現(xiàn),GSRd的表觀遺傳調控機制有可能成為治療CCH相關疾病的有效干預靶標。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743
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本文編號：2547540