【摘要】：第一部分酸敏感離子通道1a在MES 23.5細胞以及斑馬魚體內的表目的:酸敏感離子通道(Acid sensing ion channels,ASICs)是一類胞外酸化激活的非電壓門控的陽離子通道。本實驗從基因和蛋白水平檢測MES 23.5細胞和斑馬魚體內ASIC1a的表達,并研究該通道的功能特性,為初步探討ASIC1a在帕金森病(Parkinson′s disease,PD)發(fā)病中的作用提供動物和細胞模型。方法:體外培養(yǎng)MES 23.5細胞,RT-PCR的方法在m RNA水平檢測MES 23.5細胞ASIC1a的表達;Western blotting方法在蛋白水平檢測ASIC1a的表達;細胞免疫熒光標記的方法確定ASIC1a在MES 23.5細胞上的分布;全細胞膜片鉗檢測ASIC1a電流特性;鈣離子成像的方法檢測MES 23.5細胞上ASIC1a通道的離子通透性。免疫熒光標記和整體原位雜交方法觀察ASIC1a通道在斑馬魚體內的表達分布;全細胞膜片鉗檢測ASIC1電流特性;行為學實驗檢測ASIC1對斑馬魚視覺功能的影響。結果:(1)從基因和蛋白水平證實ASIC1a在MES 23.5細胞上有表達。ASIC1a主要分布在胞膜和胞漿,與酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)有共表達。(2)MES 23.5細胞胞外酸化可誘發(fā)出ASICs電流,該電流可被阿米洛利(Amiloride)和ASIC1a特異性抑制劑狼蛛毒素(Pc Tx1)阻斷。(3)斑馬魚的腦部和眼球存在ASIC1基因和蛋白的表達,但是未能觀察到與TH的共定位。(4)斑馬魚視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細胞上記錄到ASICs電流。(5)阻滯ASIC1會造成斑馬魚視覺功能障礙。結論:(1)MES 23.5細胞上存在功能性ASIC1a的表達。(2)斑馬魚的視網(wǎng)膜上存在ASIC1的表達,主要分布在視神經(jīng)節(jié)細胞層、內板狀層、內核層、外板狀層以及感光細胞層。阻滯ASIC1的活性能夠降低斑馬魚對光的敏感性,提示ASIC1可能參與斑馬魚視覺功能的調控。本實驗為探討ASIC1a在PD發(fā)病中的作用提供了實驗基礎以及簡單易行的模型。第二部分酸敏感離子通道1a對胞外酸化誘導的多巴胺遞質釋放的調控及其分子機制目的:研究ASIC1a對多巴胺遞質釋放的調節(jié),探討ASIC1a在PD發(fā)病中的作用機制,并觀察阻滯ASIC1a能否減輕PD模型中DA神經(jīng)元的損傷。方法:以MPP+誘導的MES 23.5細胞為研究對象,免疫印跡技術檢測MES 23.5細胞ASIC1a、TH、Ca MKII的蛋白表達變化。全細胞膜片鉗技術檢測ASIC1a電流大小及電流特性的變化;高效液相色譜法檢測細胞內外DA的水平,計算DA釋放率[胞外含量/(胞內+胞外含量)×100%]。不同濃度Pc Tx1(0.1n M-10n M)預處理細胞1h,加入MPP+(10u M)作用12h后,MTT法測定各組細胞的存活率和損傷程度。結果:(1)在MPP+誘導的MES 23.5細胞模型中,ASIC1a蛋白水平和電流幅度顯著增加。(2)以高鉀刺激作為陽性對照,胞外酸化可明顯增加MES 23.5細胞DA遞質釋放,該作用可被ASIC1a通道阻斷劑Pc Tx1抑制。(3)在MPP+誘導的MES 23.5細胞模型中,Ca MKII蛋白水平顯著增加;無鈣外液和Ca MKII抑制劑KN-93減少酸化引起的DA遞質釋放增加。(4)MPP+處理12小時后,細胞存活率明顯下降;Pc Tx1預處理1h,細胞存活率顯著上升,與MPP+組相比有統(tǒng)計差異。(5)MPP+顯著降低MES 23.5細胞中TH蛋白的表達;與MPP+組相比,Pc Tx1(10n M)預處理1h后,TH蛋白的表達明顯升高。結論:組織酸化引起黑質DA神經(jīng)元上ASIC1a的激活,增加Ca2+的內流,促進DA遞質釋放;同時Ca2+內流通過激活Ca MKII(Ca2+/Ca MKII信號通路),上調ASICla通道的功能,進一步促進Ca2+內流,造成胞內DA遞質減少,最終導致DA遞質耗竭、DA神經(jīng)元損傷或凋亡。抑制ASIC1a的活性,可減輕其對DA神經(jīng)元的毒性,從而對細胞發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用。
【圖文】：

自動成像系統(tǒng)激動記錄數(shù)據(jù)和視頻。程序結束后，對數(shù)終運動活性值。據(jù)統(tǒng)計分析據(jù)分析的軟件主要有： SPSS 17.0 和 GrapHPad Prism 6 統(tǒng)計驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示。用 t-檢驗（ student’s t-test，包比較兩組數(shù)據(jù)之間的差異性；多組間比較采用方差分析；不數(shù)檢驗。當 P < 0.05 為有統(tǒng)計學意義。結 果S 23.5 細胞表達 asic1a mRNA實 MES 23.5 細胞上存在 ASIC1a，首先應用 RT-PCR 法在 M1a mRNA 的表達。以大鼠皮層神經(jīng)元作為陽性對照， gapdh發(fā)現(xiàn)，asic1a 在 MES 23.5 細胞上有表達，目的基因大小為 1

圖 2：ASIC1a 在 MES 23.5 細胞上的蛋白水平表達。經(jīng)元作為陽性參照物，GAPDH 作為內參。目的蛋白的分子量為S 23.5 細胞上 ASIC1a 的分布特點察 ASIC1a 在 MES 23.5 細胞上的分布，我們分別用 TH 抗體標標記 ASIC1a 通道， 進行免疫熒光雙標。 如圖 3 所示， 綠色熒代表 TH，藍色為 DAPI 標記的細胞核，結果發(fā)現(xiàn)， ASIC1 均胞質中，，并且和多巴胺合成的關鍵酶 TH 有共表達，提示在 MESC1a 的這種分布特點具有特異性。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5

【參考文獻】

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1 譚健;許益聘;劉廣鵬;葉信海;;Involvement of Acid-sensing Ion Channel 1a in Functions of Cultured Human Retinal Pigment Epithelial Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年01期

本文編號：2529194