發(fā)布時間：2019-08-26 10:06

【摘要】：第一部分酸敏感離子通道1a在MES 23.5細(xì)胞以及斑馬魚體內(nèi)的表目的:酸敏感離子通道(Acid sensing ion channels,ASICs)是一類胞外酸化激活的非電壓門控的陽離子通道。本實(shí)驗從基因和蛋白水平檢測MES 23.5細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)ASIC1a的表達(dá),并研究該通道的功能特性,為初步探討ASIC1a在帕金森病(Parkinson′s disease,PD)發(fā)病中的作用提供動物和細(xì)胞模型。方法:體外培養(yǎng)MES 23.5細(xì)胞,RT-PCR的方法在m RNA水平檢測MES 23.5細(xì)胞ASIC1a的表達(dá);Western blotting方法在蛋白水平檢測ASIC1a的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的方法確定ASIC1a在MES 23.5細(xì)胞上的分布;全細(xì)胞膜片鉗檢測ASIC1a電流特性;鈣離子成像的方法檢測MES 23.5細(xì)胞上ASIC1a通道的離子通透性。免疫熒光標(biāo)記和整體原位雜交方法觀察ASIC1a通道在斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)分布;全細(xì)胞膜片鉗檢測ASIC1電流特性;行為學(xué)實(shí)驗檢測ASIC1對斑馬魚視覺功能的影響。結(jié)果:(1)從基因和蛋白水平證實(shí)ASIC1a在MES 23.5細(xì)胞上有表達(dá)。ASIC1a主要分布在胞膜和胞漿,與酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)有共表達(dá)。(2)MES 23.5細(xì)胞胞外酸化可誘發(fā)出ASICs電流,該電流可被阿米洛利(Amiloride)和ASIC1a特異性抑制劑狼蛛毒素(Pc Tx1)阻斷。(3)斑馬魚的腦部和眼球存在ASIC1基因和蛋白的表達(dá),但是未能觀察到與TH的共定位。(4)斑馬魚視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上記錄到ASICs電流。(5)阻滯ASIC1會造成斑馬魚視覺功能障礙。結(jié)論:(1)MES 23.5細(xì)胞上存在功能性ASIC1a的表達(dá)。(2)斑馬魚的視網(wǎng)膜上存在ASIC1的表達(dá),主要分布在視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)板狀層、內(nèi)核層、外板狀層以及感光細(xì)胞層。阻滯ASIC1的活性能夠降低斑馬魚對光的敏感性,提示ASIC1可能參與斑馬魚視覺功能的調(diào)控。本實(shí)驗為探討ASIC1a在PD發(fā)病中的作用提供了實(shí)驗基礎(chǔ)以及簡單易行的模型。第二部分酸敏感離子通道1a對胞外酸化誘導(dǎo)的多巴胺遞質(zhì)釋放的調(diào)控及其分子機(jī)制目的:研究ASIC1a對多巴胺遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié),探討ASIC1a在PD發(fā)病中的作用機(jī)制,并觀察阻滯ASIC1a能否減輕PD模型中DA神經(jīng)元的損傷。方法:以MPP+誘導(dǎo)的MES 23.5細(xì)胞為研究對象,免疫印跡技術(shù)檢測MES 23.5細(xì)胞ASIC1a、TH、Ca MKII的蛋白表達(dá)變化。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測ASIC1a電流大小及電流特性的變化;高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)外DA的水平,計算DA釋放率[胞外含量/(胞內(nèi)+胞外含量)×100%]。不同濃度Pc Tx1(0.1n M-10n M)預(yù)處理細(xì)胞1h,加入MPP+(10u M)作用12h后,MTT法測定各組細(xì)胞的存活率和損傷程度。結(jié)果:(1)在MPP+誘導(dǎo)的MES 23.5細(xì)胞模型中,ASIC1a蛋白水平和電流幅度顯著增加。(2)以高鉀刺激作為陽性對照,胞外酸化可明顯增加MES 23.5細(xì)胞DA遞質(zhì)釋放,該作用可被ASIC1a通道阻斷劑Pc Tx1抑制。(3)在MPP+誘導(dǎo)的MES 23.5細(xì)胞模型中,Ca MKII蛋白水平顯著增加;無鈣外液和Ca MKII抑制劑KN-93減少酸化引起的DA遞質(zhì)釋放增加。(4)MPP+處理12小時后,細(xì)胞存活率明顯下降;Pc Tx1預(yù)處理1h,細(xì)胞存活率顯著上升,與MPP+組相比有統(tǒng)計差異。(5)MPP+顯著降低MES 23.5細(xì)胞中TH蛋白的表達(dá);與MPP+組相比,Pc Tx1(10n M)預(yù)處理1h后,TH蛋白的表達(dá)明顯升高。結(jié)論:組織酸化引起黑質(zhì)DA神經(jīng)元上ASIC1a的激活,增加Ca2+的內(nèi)流,促進(jìn)DA遞質(zhì)釋放;同時Ca2+內(nèi)流通過激活Ca MKII(Ca2+/Ca MKII信號通路),上調(diào)ASICla通道的功能,進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+內(nèi)流,造成胞內(nèi)DA遞質(zhì)減少,最終導(dǎo)致DA遞質(zhì)耗竭、DA神經(jīng)元損傷或凋亡。抑制ASIC1a的活性,可減輕其對DA神經(jīng)元的毒性,從而對細(xì)胞發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。
【圖文】：

自動成像系統(tǒng)激動記錄數(shù)據(jù)和視頻。程序結(jié)束后，對數(shù)終運(yùn)動活性值。據(jù)統(tǒng)計分析據(jù)分析的軟件主要有： SPSS 17.0 和 GrapHPad Prism 6 統(tǒng)計驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用 t-檢驗（ student’s t-test，包比較兩組數(shù)據(jù)之間的差異性；多組間比較采用方差分析；不數(shù)檢驗。當(dāng) P < 0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié) 果S 23.5 細(xì)胞表達(dá) asic1a mRNA實(shí) MES 23.5 細(xì)胞上存在 ASIC1a，首先應(yīng)用 RT-PCR 法在 M1a mRNA 的表達(dá)。以大鼠皮層神經(jīng)元作為陽性對照， gapdh發(fā)現(xiàn)，asic1a 在 MES 23.5 細(xì)胞上有表達(dá)，目的基因大小為 1

圖 2：ASIC1a 在 MES 23.5 細(xì)胞上的蛋白水平表達(dá)。經(jīng)元作為陽性參照物，GAPDH 作為內(nèi)參。目的蛋白的分子量為S 23.5 細(xì)胞上 ASIC1a 的分布特點(diǎn)察 ASIC1a 在 MES 23.5 細(xì)胞上的分布，我們分別用 TH 抗體標(biāo)標(biāo)記 ASIC1a 通道， 進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。 如圖 3 所示， 綠色熒代表 TH，藍(lán)色為 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， ASIC1 均胞質(zhì)中，，并且和多巴胺合成的關(guān)鍵酶 TH 有共表達(dá)，提示在 MESC1a 的這種分布特點(diǎn)具有特異性。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 譚健;許益聘;劉廣鵬;葉信海;;Involvement of Acid-sensing Ion Channel 1a in Functions of Cultured Human Retinal Pigment Epithelial Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年01期

本文編號：2529194