【摘要】：背景和目的： 目前,腫瘤是危險(xiǎn)人類生命健康的頭等殺手。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤,屬于WHO IV級(jí),是一種最常見最致命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,年發(fā)生率為4.96/100,000,占所有膠質(zhì)瘤里面的50%。目前的傳統(tǒng)性的治療手段包括外科手術(shù)、放療和化療以及其它綜合性的治療。雖然過去對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步,但是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存率依然很低。由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤存在于大腦皮層的白質(zhì)這種特殊的位置,并且由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)速度快、侵潤(rùn)性強(qiáng),因此患者病程短,平均存活周期只有大約15個(gè)月左右,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者經(jīng)診斷后大約95%未經(jīng)治療的患者生存期不超過3個(gè)月。因此,發(fā)展更有效的診斷和治療手段對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行治療刻不容緩。過去大量的研究表明,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展和一個(gè)復(fù)雜的過程,主要涉及到細(xì)胞內(nèi)部原癌基因或者抑癌基因的表達(dá)失調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)控的異常激活或者失調(diào)。因而,進(jìn)一步闡明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制將對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷、預(yù)防和治療就顯得非常重要。盡管過去對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在分子水平上的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了大量研究并取得了很多成果,但是對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的具體分子發(fā)生機(jī)制仍然大部分不為人知。 MicroRNA是一類非編碼的小分子單鏈RNA, Lee等于1993年首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)microRNA,并發(fā)現(xiàn)其參與了對(duì)新秀麗線蟲的胚胎后發(fā)育的調(diào)節(jié)。后來在多種物種包括動(dòng)物,植物中都發(fā)現(xiàn)了microRNA的存在。人類中也發(fā)現(xiàn)了多達(dá)400多種microRNA的存在,據(jù)估計(jì)可能在人類中存在多達(dá)1000種的microRNA。 MicroRNA通過與靶基因mRNA序列的3’非翻譯區(qū)或者編碼區(qū)內(nèi)含子區(qū)域的特異結(jié)合,影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性,或者可以直接抑制靶基因的蛋白翻譯,進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。累積的研究表明,MicroRNA作為一種重要的調(diào)節(jié)因子,參與了對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡和代謝等生理過程。由于microRNA對(duì)于正常細(xì)胞生理活動(dòng)調(diào)節(jié)的重要性,一旦microRNA的調(diào)節(jié)失控將引起一系列的分子事件,導(dǎo)致正常細(xì)胞細(xì)胞周期、增殖、轉(zhuǎn)移和侵潤(rùn)等生物學(xué)行為改變,促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤的生成和發(fā)展。因此通過microRNA干預(yù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生以及增殖將成為未來治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種新的策略。 MicroRNA-124是一個(gè)在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)很豐富的miRNA,參與了對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,代謝等重要的生理過程的調(diào)節(jié)。在本文的研究中,為了確定microRNA-124在調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分化和增殖、侵潤(rùn)過程中的作用,首先通過比較分析microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和正常腦組織的表達(dá)差異,然后通過生物信息學(xué)對(duì)microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中潛在的靶基因進(jìn)行了分析,并進(jìn)一步分析了microRNA-124以及靶基因PPP1R13L對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化和增殖的調(diào)節(jié)。 方法和結(jié)果： l.microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)顯著下降：通過實(shí)時(shí)定量Real-time PCR方法,我們檢測(cè)了9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織以及7組癌旁腦組織中microRNA-124的表達(dá)水平,結(jié)果表明,與癌旁腦組織相比,microRNA-124在這9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)都顯著性的下調(diào),下降幅度基本上都達(dá)到幾乎3.5倍,說明microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)顯著下降了。 2. microRNA-124負(fù)調(diào)控了靶基因PPP1R13L的表達(dá)：通過采用生物信息學(xué)軟件TargetScan對(duì)PPP1R13L基因mRNA的3’非翻譯區(qū)進(jìn)行了潛在microRNA結(jié)合位點(diǎn)分析,發(fā)現(xiàn)PPP1R13L基因mRNA的3’非翻譯區(qū)存在兩個(gè)microRNA-124結(jié)合位點(diǎn),其中一個(gè)位點(diǎn)位于人PPP1R13L基因mRNA的3’非翻譯區(qū)下游約180bp處,在多個(gè)物種之間都存在高度保守性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA-124能否直接調(diào)節(jié)PPP1R13L基因,我們構(gòu)建了包含PPP1R13L3'非翻譯區(qū)野生型全長(zhǎng)序列、保守結(jié)合位點(diǎn)突變序列突變體的熒光素酶報(bào)告基因載體。通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明了,microRNA-124能夠顯著的抑制包含PPP1R13L3'非翻譯區(qū)野生型全長(zhǎng)序列的報(bào)告基因的表達(dá),但是對(duì)包含保守結(jié)合位點(diǎn)突變序列突變型載體的報(bào)告基因的表達(dá)沒有影響。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明了,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U373細(xì)胞系中,microRNA-124能夠顯著的抑制PPP1R13L的mRNA水平。進(jìn)一步通過Western blot實(shí)驗(yàn)證明了,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和U373細(xì)胞系中,microRNA-124能夠顯著的抑制PPP1R13L的蛋白水平。以上的結(jié)果說明,PPP1R13L作為microRNA-124的直接靶基因,被其負(fù)調(diào)控。 3. microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖：通過MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)相比于過表達(dá)對(duì)照組,過表達(dá)microRNA-124能夠極大的降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的增殖,而過表達(dá)microRNA-124抑制物能顯著的增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的增殖。說明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。 4. microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)：通過流式細(xì)胞技術(shù),發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組,過表達(dá)microRNA-124能夠極大的抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期,而過表達(dá)microRNA-124抑制物能顯著的促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。說明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。 5. microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)：通過Transwell小室實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組,過表達(dá)microRNA-124能夠極大的抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的侵潤(rùn),而過表達(dá)microRNA-124抑制物能顯著的促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U251和U373的侵潤(rùn)。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)microRNA-124抑制了U251和U373細(xì)胞中的MMP-9和MMP-13的表達(dá),過表達(dá)microRNA-124抑制物促進(jìn)了U251和U373細(xì)胞中的MMP-9和MMP-13的表達(dá)。說明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1.首次通過Real-Time PCR證明了microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)。進(jìn)一步提示microRNA-124作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)記物。 2.首次證明microRNA-124通過靶向PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和遷移。進(jìn)一步證明了microRNA-124可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的干預(yù)治療靶點(diǎn)。 結(jié)論： 本研究證明了microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中低表達(dá),并且證明了PPP1R13L為microRNA-124負(fù)調(diào)節(jié)的靶基因,進(jìn)而闡明了micorRNA-124通過靶向調(diào)節(jié)PPP1R13L抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和侵襲的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)microRNA-124在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的生物學(xué)作用,暗示microRNA-124可能作為以后治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖1-1.質(zhì)粒psiCHECKTM-2示意圖psiCHECKTM-2報(bào)告基因載體包含兩個(gè)報(bào)告基因：海腎蛋光素酶基因和童蟲突光素酶基因。在海腎蜜光素酶基因的下游插入3’非翻譯區(qū)。就可以通過

圖1-7. microRNA-124在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤/相應(yīng)正常腦組織中的相對(duì)表達(dá)通過突光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及相應(yīng)正常腦roRNA-124的表達(dá)情況。圖中縱坐標(biāo)表示rnicroRNA-124在腦膠質(zhì)母
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2526907