【摘要】：目的研究purα蛋白對(duì)鋰-匹羅卡品致癇大鼠行為學(xué)、神經(jīng)元凋亡及認(rèn)知功能的影響,探討purα對(duì)癲癇發(fā)生的預(yù)防作用及機(jī)制。材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),按照相應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)則進(jìn)行。選擇雄性Sparague-Dawley(SD)大鼠。挑選標(biāo)準(zhǔn)為:成年大鼠,6~8周,體重在200~250g之間。飼養(yǎng)條件:避光,適宜的溫度和濕度24小時(shí)晝夜循環(huán)。90只SD大鼠隨機(jī)分為Purα過(guò)表達(dá)組、沉默組、對(duì)照組共三組,每組30只。每組隨機(jī)選取大鼠,以40mg/kg體重標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜,確定大鼠海馬CA1區(qū)(前囟后3.6mm,旁開2.2mm,深度2.5mm),用微量注射器緩慢推注4μL慢病毒懸液(5×108TU病毒顆粒)。對(duì)照組按上述同樣方法和坐標(biāo),注射同等體積生理鹽水完成手術(shù)過(guò)程。手術(shù)完畢后將大鼠放回籠內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)且連續(xù)2天給予腹腔注射青霉素5萬(wàn)U/d防止感染。注射病毒二周后每組隨機(jī)選取10只大鼠斷頭取腦,剝離出海馬組織,通過(guò)和Western Blotting證實(shí)Purα慢病毒已經(jīng)在海馬組織表達(dá);其余每組20只大鼠用匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇;根據(jù)Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)來(lái)判定癲癇發(fā)作級(jí)別,若癲癇發(fā)作達(dá)到Ⅲ~Ⅴ級(jí)則視為成功。若癲癇未發(fā)作或發(fā)作沒(méi)有達(dá)到Ⅲ級(jí)則按要求每30min增加注射一次匹羅卡品,增加劑量為10mg/kg,補(bǔ)充的總注射次數(shù)最多不超過(guò)3次。癲癇發(fā)作1小時(shí)后觀察記錄大鼠的行為學(xué)變化,癲癇發(fā)作3d后每組選取10只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共5天,可分為空間搜索實(shí)驗(yàn)及定位巡航實(shí)驗(yàn)兩部分。巡航實(shí)驗(yàn)記錄4天(4次/d),觀察各組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。第5天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn),記錄大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)穿越平臺(tái)象限的次數(shù)及停留時(shí)間,作為判斷大鼠空間記憶能力參考指標(biāo)。其余每組大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材,一部分?jǐn)囝^剝離腦組織取海馬CA1區(qū)組織進(jìn)行凍存;一部分大鼠行活體灌注取材石蠟包埋;取材進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)Caspase-3表達(dá)水平;通過(guò)Western-Blot及免疫組織化學(xué)檢測(cè)海馬神經(jīng)元caspase-3的表達(dá)變化水平。統(tǒng)計(jì)分析使用spss20.0軟件比較分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x士s來(lái)表示。用單因素方差分析(one-wayanova)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較,組間比較采用lsd法,當(dāng)各組的方差不齊時(shí)用dunnett法進(jìn)行均數(shù)間的兩兩比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.morris水迷宮實(shí)驗(yàn):purα沉默組癲癇大鼠與其他兩組相比較,逃避潛伏期時(shí)間長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。purα過(guò)表達(dá)癲癇組與癲癇模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加,各組逃避潛伏期也逐漸呈縮短趨勢(shì),purα過(guò)表達(dá)癲癇組大鼠與其他兩組相比較,縮短趨勢(shì)并不明顯。平臺(tái)象限滯留時(shí)間三組之間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。平臺(tái)象限穿越次數(shù),purα過(guò)表達(dá)癲癇組大鼠與沉默組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與癲癇模型組相比差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.purα蛋白在海馬區(qū)域的表達(dá):海馬ca1區(qū)注射高滴度的purα慢病毒顆粒2周后,提取海馬組織蛋白,免疫印跡結(jié)果顯示purα蛋白表達(dá)量在purα過(guò)表達(dá)組表達(dá)明顯增高,沉默組則明顯降低;三組之間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明purɑ慢病毒對(duì)海馬組織進(jìn)行基因?qū)哟紊系母深A(yù)是成功的。3.癲癇大鼠海馬ca1區(qū)he染色結(jié)果癲癇誘導(dǎo)成功三天后,海馬形態(tài)及病理改變。癲癇模型組細(xì)胞排列規(guī)則,細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠完整。purα過(guò)表達(dá)組,細(xì)胞排列緊密,結(jié)構(gòu)相對(duì)完整清晰,染色質(zhì)均勻分布。沉默組,細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,神經(jīng)元變性壞死,間距加大,存在明顯神經(jīng)元凋亡。4.免疫組織化學(xué)染色:匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作3d后,與癲癇模型組和沉默組相比,purα過(guò)表達(dá)組偶見棕染細(xì)胞、著色較淺;癲癇模型組陽(yáng)性細(xì)胞較過(guò)表達(dá)組多;沉默組,可見大量陽(yáng)性細(xì)胞,其胞漿和胞核內(nèi)均有棕黃色或棕褐色顆粒沉著。說(shuō)明purα對(duì)癲癇發(fā)作所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用,沉默purα基因的表達(dá),可使得癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡加重。5.western-blot:caspase-3的表達(dá)水平,各組大鼠海馬中caspase-3均有表達(dá),與癲癇模型組和過(guò)表達(dá)組相比較,沉默組表達(dá)明顯增高。癲癇模型組與過(guò)表達(dá)組相比(p0.05)。過(guò)表達(dá)與沉默組相比(p0.01)。這一結(jié)果與免疫組織化學(xué)觀察到的結(jié)果是吻合的,說(shuō)明Purα能夠減輕癲癇導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。結(jié)論purα能減輕因癲癇發(fā)作導(dǎo)致的DNA損傷,對(duì)致癇大鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1A 為大鼠限停留時(shí)間；1B 為平臺(tái)象限穿越次數(shù)；a,b 與沉默組相比，（aP<0.01表 1 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較（x ±s）逃避潛伏期（s）停留時(shí)間(s第 1d 第 2d 第 3d 第 4d

正常組相比#p<0.05；與沉默組相比*p<0.01；A-1，A-2，A-3 分別為過(guò)表達(dá)圖 2 Purɑ慢病毒在海馬區(qū)域中的表達(dá). Purɑ慢病毒對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)的影響根據(jù) Racine 評(píng)分判定癲癇發(fā)作級(jí)別：0 級(jí)無(wú)驚厥；一級(jí)可見大
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：2520043