【摘要】：多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病,目前病因不明,可能與遺傳、居住環(huán)境、飲食、營養(yǎng)以及體內(nèi)激素變化等有關(guān)。MS的起病源自與自身髓鞘結(jié)構(gòu)相似的抗原激活CD4+T細(xì)胞,激活后的CD4+T細(xì)胞分化為Th1,Th17等效應(yīng)細(xì)胞,攻擊自身髓鞘組織,引發(fā)髓鞘脫失和軸索損傷。MS患者的癥狀多種多樣,可有疲勞、肢體癱瘓、麻木、視力下降、自主神經(jīng)功能紊亂等,由于MS主要發(fā)病于中青年,癥狀往往遷延反復(fù),不斷惡化直至殘疾,給家庭和社會(huì)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。MS的治療主要分為急性期治療和緩解期治療,急性期主要采用激素、免疫球蛋白沖擊、血漿置換等;緩解期主要采用β-干擾素,改善病程治療藥物等。但是,目前的治療手段只對部分患者有效且不能徹底治愈MS。本研究的目的是在MS的動(dòng)物模型:實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)上研究新的治療方法,為臨床應(yīng)用提供理論支持。本研究的第一部分研究骨髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞(Bone Marrow-derived Neural Stem Cell,BM-NSC)對EAE的治療效果,同時(shí)應(yīng)用TGF-β1基因修飾BM-NSC,制作過表達(dá)TGF-β1的BM-NSC(TGF-β1-BM-NSC),比較TGF-β1-BM-NSC與普通BM-NSC對EAE治療作用的差異。本研究第二部分檢驗(yàn)了HIF-1抑制劑BAY87-2243對EAE的治療作用,同時(shí)研究了BAY 87-2243對中樞和外周免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用以及對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte precursor cell,OPC)增殖分化的影響。第一部分:過表達(dá)TGF-β1的骨髓來源神經(jīng)干細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎治療作用的研究方法:(1)培養(yǎng)BM-NSC并使用包含TGF-β1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BM-NSC,篩選出TGF-β1-BM-NSC;(2)使用MOG35-55誘導(dǎo)EAE模型,在EAE發(fā)病前與發(fā)病高峰期分別尾靜脈注射1×106的BM-NSC,TGF-β1-BM-NSC或同等劑量的生理鹽水;(3)每日評(píng)估EAE臨床癥狀評(píng)分和體重;(4)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,提取中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的CD4+T細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀分析Th1,Th17以及Treg細(xì)胞的比例;(5)流式細(xì)胞儀分析EAE小鼠外周免疫系統(tǒng)內(nèi)CD4+T細(xì)胞特異性分化為Th1,Th17以及Treg細(xì)胞的比例;檢測EAE小鼠外周免疫細(xì)胞抗原特異性的增殖和炎性因子分泌能力;(6)對EAE小鼠脊髓組織行HE和LFB染色,觀察中樞內(nèi)炎性浸潤和炎性脫髓鞘情況;(7)制作中樞神經(jīng)組織冰凍切片,觀察BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC在體內(nèi)的分化。結(jié)果:(1)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC皆可生長為典型的神經(jīng)球,分化為神經(jīng)元,少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞;BM-NSC培養(yǎng)液的上清中幾乎檢測不出TGF-β1,而TGF-β1-BM-NSC培養(yǎng)液的上清中TGF-β1的平均濃度為488 pg/ml;(2)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC注射均可以延緩EAE的發(fā)病,減輕EAE小鼠的殘疾癥狀;(3)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC注射均可以減輕EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤和髓鞘脫失;(4)相對于生理鹽水治療組,BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC治療組EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的CD4+T細(xì)胞的比例和數(shù)量明顯降低,Th1細(xì)胞的比例和數(shù)量明顯降低,Th17以及Treg細(xì)胞的數(shù)量降低;(5)BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC顯著降低EAE小鼠周圍免疫系統(tǒng)中CD4+T細(xì)胞向Th1及Th17細(xì)胞分化的比例,增加Treg細(xì)胞分化的比例;同時(shí)降低外周淋巴細(xì)胞的抗原特異性增殖和炎癥因子的分泌;(6)注射的BM-NSC和TGF-β1-BM-NSC在EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,也有部分NSC未分化,保持干性;(7)相比于普通BM-NSC,TGF-β1-BM-NSC緩解EAE臨床癥狀評(píng)分,減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性浸潤和髓鞘脫失,調(diào)節(jié)免疫的能力有所增強(qiáng),而在體內(nèi)以及體外分化為各種神經(jīng)細(xì)胞的比例與普通BM-NSC無明顯差異。討論:由于TGF-β1可以單獨(dú)誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的生成,所以我們將TGF-β1基因?qū)隑M-NSC,希望增強(qiáng)其調(diào)節(jié)免疫和治療EAE的能力。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,TGF-β1-BM-NSC治療明顯增加了外周免疫系統(tǒng)內(nèi)Treg細(xì)胞的比例,相應(yīng)地Th1及Th17細(xì)胞的比例則明顯下降。此外,TGF-β1的導(dǎo)入還降低了炎性因子的分泌和外周免疫細(xì)胞抗原特異性的增殖,我們推測這可能是由于外周Treg細(xì)胞比例的上升所引發(fā)的對于免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)的結(jié)果。由于對外周異常免疫反應(yīng)抑制的增強(qiáng),進(jìn)入中樞的CD4+T細(xì)胞的比例和數(shù)量均明顯下降,相應(yīng)地,EAE小鼠的臨床癥狀和炎性脫髓鞘也明顯地減輕。綜上,BM-NSC可以有效緩解EAE的癥狀,而過表達(dá)TGF-β1的BM-NSC由于調(diào)節(jié)免疫的能力增強(qiáng),對EAE的治療作用顯著增強(qiáng)。第二部分:HIF-1抑制劑BAY 87-2243對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎治療作用的研究方法:(1)使用臺(tái)盼藍(lán)染色和MTS試劑盒檢測不同濃度的BAY 87-2243在體外對CD4+T細(xì)胞數(shù)量和活性的影響;(2)分別使用Brd U試劑盒和Annexin V-PI復(fù)染檢測不同濃度的BAY 87-2243對CD4+T細(xì)胞增殖和凋亡的影響;(3)流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的BAY 87-2243對CD4+T細(xì)胞向Th1,Th2,Th17以及Treg細(xì)胞分化的影響;(4)檢測不同濃度的BAY 87-2243對OPC增殖和分化的影響;(5)誘導(dǎo)EAE模型并在EAE發(fā)病前和高峰期后分別口服給予4 mg/kg的BAY 87-2243,記錄EAE小鼠的臨床癥狀評(píng)分;(6)見第一部分方法(4)至(6)。結(jié)果:(1)1至1000 n Mol的BAY 87-2243在體外不影響CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和活力;(2)1至1000 n Mol的BAY 87-2243在體外不影響CD4+T細(xì)胞的凋亡,低濃度的BAY(1至100 n Mol)不影響CD4+T細(xì)胞的增殖,高濃度的BAY 87-2243(500n Mol,1000 n Mol)抑制CD4+T細(xì)胞的增殖;(3)BAY 87-2243顯著地降低CD4+T細(xì)胞向Th1,Th17細(xì)胞的分化,而促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化;(4)BAY 87-2243促進(jìn)低營養(yǎng)條件下OPC的增殖,但并不影響其分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞;(5)BAY87-2243可以延緩EAE的發(fā)病,降低EAE小鼠的臨床殘疾評(píng)分,減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎性浸潤和髓鞘脫失;(6)BAY 87-2243顯著減少了EAE小鼠中樞內(nèi)的CD4+T細(xì)胞的比例和數(shù)量,Th1及Th17細(xì)胞的數(shù)量也明顯降低;(7)BAY 87-2243顯著降低EAE小鼠周圍免疫系統(tǒng)中CD4+T細(xì)胞向Th1及Th17細(xì)胞分化的比例,增加向Treg細(xì)胞分化的比例;同時(shí)減輕了外周淋巴細(xì)胞的抗原特異性增殖和炎癥因子的分泌;(8)BAY 87-2243抑制了EAE小鼠中樞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)。討論:HIF-1在控制CD4+T細(xì)胞向Th17/Treg細(xì)胞的分化中扮演關(guān)鍵角色,其可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化,抑制其向Treg細(xì)胞分化。所以我們引入HIF-1的特異性抑制劑BAY 87-2243,將其應(yīng)用于EAE的治療,希望可以抑制Th17細(xì)胞的生成,增加Treg細(xì)胞的生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BAY 87-2243確實(shí)可以通過抑制HIF-1α的表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫�？诜﨎AY 87-2243后,治療組EAE小鼠外周免疫系統(tǒng)內(nèi)的Th1和Th17細(xì)胞比例明顯下降,而Treg細(xì)胞的比例明顯升高,此外,抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖和促炎因子的分泌也被抑制。從臨床評(píng)分上也可以看出BAY87-2243可以延緩、減輕EAE小鼠的臨床殘疾癥狀,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失也有所減輕。以上的結(jié)果印證了我們的設(shè)想,BAY 87-2243通過特異性抑制HIF-1,調(diào)整Th17/Treg細(xì)胞的分化平衡,發(fā)揮對EAE的治療作用。全文總結(jié)通過上述兩部分的研究,我們分別評(píng)估了TGF-β1-BM-NSC和BAY 87-2243對EAE的治療作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-β1-BM-NSC和BAY 87-2243都可以延緩、減輕EAE的癥狀,促進(jìn)EAE小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù),這對于MS的治療是十分有價(jià)值的。兩種治療手段都是通過調(diào)節(jié)免疫尤其是Th17/Treg細(xì)胞的平衡來發(fā)揮治療作用,此外,TGF-β1-BM-NSC還可以通過神經(jīng)營養(yǎng)和細(xì)胞修復(fù)作用來促進(jìn)髓鞘修復(fù),而BAY 87-2243同樣可以在低營養(yǎng)條件下增強(qiáng)OPC的增殖來促進(jìn)內(nèi)源性髓鞘修復(fù)。綜上,本研究充分證明了TGF-β1-BM-NSC和BAY 87-2243對EAE的治療作用,為臨床治療MS提供了新的思路。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 圖 1：BM-NSC 的培養(yǎng)A：培養(yǎng)骨髓來源的 NSC，，懸浮培養(yǎng)，傳 3 代后，細(xì)胞成球狀，Nestin 陽性（100×）；B：貼壁后，細(xì)胞生出突起，仍 Nestin 陽性（100×）。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： TGF-β1-BM-NSC 與對照 BM-NSC 以不同密度種植于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使用 Br標(biāo)記檢測增殖能力。如圖 4 所示：兩種 BM-NSC 的增殖曲線幾乎相同，隨著種植度的增加，BrdU 吸收值逐漸增高，由 102/ml 時(shí)的 0.2 增加到 105/ml 時(shí)的 0.9，而景（無 BrdU）吸收值為 0.1。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R744.51

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本文編號(hào)：2512980