【摘要】：研究背景 人膠質(zhì)瘤(Glioma)起源于神經(jīng)上皮外胚層,在臨床神經(jīng)外科工作中是最常見(jiàn)的的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤,發(fā)病率高,在顱內(nèi)腫瘤中可達(dá)到40%-50%,在我國(guó),腦膠質(zhì)瘤占居顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的首位。近年腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì),以青壯年為主要發(fā)病人群。腦膠質(zhì)瘤病理類(lèi)型包括少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤等,其中以多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤多見(jiàn),發(fā)病部位于大腦半球多見(jiàn)。WHO根據(jù)病理組織學(xué)特點(diǎn)將原發(fā)膠質(zhì)瘤分為4級(jí),級(jí)別增高代表惡性程度增加,Ⅰ-Ⅱ級(jí)是低分級(jí)膠質(zhì)瘤,Ⅲ-Ⅳ級(jí)是高分級(jí)膠質(zhì)瘤。低分級(jí)膠質(zhì)瘤包括Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤以及毛細(xì)胞型細(xì)胞瘤,而高分級(jí)膠質(zhì)瘤包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤。 膠質(zhì)瘤發(fā)展較快,且由于腫瘤的位置、臨近結(jié)構(gòu)以及體積的不同,臨床癥狀各不相同。臨床癥狀和體征主要包括顱內(nèi)壓增高癥狀(頭痛、嘔吐、視乳頭水腫、意識(shí)改變等)、局灶性癥狀和體征(運(yùn)動(dòng)障礙、感覺(jué)障礙、癲癇)。盡管對(duì)膠質(zhì)瘤的研究較多,但其具體發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。目前認(rèn)為誘發(fā)因素可能有生物因素、遺傳因素、環(huán)境因素(包括物理因素、化學(xué)因素等)多種因素共同作用。臨床上以病理組織學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行診斷并分級(jí)。但是單純依靠組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行診斷并分級(jí)存在一定弊端,尤其是根據(jù)立體定向進(jìn)行病理取材的標(biāo)本通常較小,有時(shí)所取材組織可能缺乏典型的病理改變,常常不能根據(jù)其病理變化準(zhǔn)確判斷病情嚴(yán)重程度。膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有自身的病理及細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展特點(diǎn),惡性細(xì)胞增殖快,呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),可浸潤(rùn)到周?chē)M織導(dǎo)致與周?chē)＝M織結(jié)構(gòu)分界不清,單純手術(shù)治療往往無(wú)法完全切除,因此導(dǎo)致手術(shù)后復(fù)發(fā)率高,成為患者死亡的主要原因。 膠質(zhì)瘤的病因、發(fā)展、臨床表現(xiàn)復(fù)雜,相應(yīng)膠質(zhì)瘤的治療方法也呈現(xiàn)多樣化,傳統(tǒng)臨床治療方案主要是以手術(shù)為主,目前已從既往的單純手術(shù)切除原發(fā)病灶演變?yōu)楫?dāng)今根據(jù)患者病情、身體狀況給予手術(shù)并相應(yīng)輔助放療和化療或放化療聯(lián)合的綜合化、個(gè)體化治療：以手術(shù)切除治療為主,包括手術(shù)、放療、化療、中醫(yī)藥治療、基因治療、免疫治療、心理治療等多個(gè)治療方案的綜合應(yīng)用。但即使經(jīng)過(guò)正規(guī)的綜合治療,仍可能存在膠質(zhì)瘤殘留,繼而增殖引起膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā),最終導(dǎo)致生存期依舊沒(méi)有得以提高,預(yù)后極差,且復(fù)發(fā)后短期死亡率非常高,因此膠質(zhì)瘤治療方式的選擇成為神經(jīng)外科醫(yī)生的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。其中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)是膠質(zhì)瘤難以根治的難關(guān)。目前各種治療方法無(wú)法達(dá)到對(duì)膠質(zhì)瘤的徹底治愈,且因?yàn)槿狈︶槍?duì)靶細(xì)胞的特異性,而造成對(duì)正常組織器官的毒副作用而對(duì)病人造成繼發(fā)損害,不僅術(shù)療后五年生存率無(wú)顯著提高,且對(duì)患者生存質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響,因此抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤侵襲特性的治療成為醫(yī)學(xué)界研究攻關(guān)難題和熱點(diǎn)。 近年對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分子生物學(xué)特征的研究取得了較大進(jìn)展,因此膠質(zhì)瘤的分子靶向治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分子生物學(xué)特征的研究中,發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞受體、基因和調(diào)控分子等密切相關(guān)。針對(duì)細(xì)胞分子水平如細(xì)胞受體、細(xì)胞信號(hào)調(diào)控分子、腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤新生血管和基因水平腫瘤相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療稱(chēng)之為分子靶向治療。在傳統(tǒng)治療中,由于對(duì)正常細(xì)胞存在繼發(fā)損傷和細(xì)胞毒作用,從而對(duì)機(jī)體造成傷害,而分子靶向治療由于具有靶向特異性、無(wú)細(xì)胞毒作用,對(duì)細(xì)胞作用穩(wěn)定,且有調(diào)節(jié)作用,故其作用優(yōu)勢(shì)明顯。 microRNA,又可被稱(chēng)為miR、小分子RNA或微小RNA,廣泛存在于動(dòng)物和植物體內(nèi),是一類(lèi)具有調(diào)控功能的非編碼蛋白質(zhì)的小分子短鏈RNA。miR廣泛存在于真核生物中,且保持高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性,暗示其在生命活動(dòng)中必不可少的調(diào)節(jié)作用,對(duì)基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育和行為等都具有廣泛和深遠(yuǎn)的效應(yīng)。miR可以負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá),其作用方式主要是miR完全或不完全的與靶基因配對(duì),或者通過(guò)抑制下游轉(zhuǎn)錄靶蛋白表達(dá),進(jìn)而對(duì)mRNA降解以及蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)。近期研究發(fā)現(xiàn),miR和膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。部分miR在膠質(zhì)瘤的表達(dá)異�；虬l(fā)生突變,且與膠質(zhì)瘤分期相關(guān),因此逐漸成為研究熱點(diǎn)。高度保守的基因調(diào)節(jié)因子miR的出現(xiàn)為腫瘤診斷、治療提供新的思路。上世紀(jì)90年代在線(xiàn)蟲(chóng)中首先發(fā)現(xiàn)miR,即lin-4可以調(diào)控線(xiàn)蟲(chóng)時(shí)序發(fā)育,進(jìn)而在水稻、果蠅、病毒、線(xiàn)蟲(chóng)、小鼠以及人類(lèi)中相繼發(fā)現(xiàn),并確定出小分子RNA,數(shù)目已超過(guò)4500種。miR主要以序列特異性的方式,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)基因表達(dá),對(duì)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)起抑制作用,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、代謝及凋亡的調(diào)控。miR一般由19-25個(gè)核苷酸組成,長(zhǎng)度為18-22nt,前體微小RNA由Drosha酶切割成70nt左右的發(fā)夾狀前體,是幾百至幾千nt大小的初級(jí)產(chǎn)物,由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生,pre-miR是miR的前身,轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),由RNA酶Ⅲ內(nèi)切酶家族的Dicer酶剪切前體微小RNA形成,從各自的pre-RNA的5'端釋放出來(lái),成為18-22nt的成熟的雙鏈miR,發(fā)揮對(duì)靶mRNA降解或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯的作用。 MicroRNA雖有眾多,但其具備共同的分子生物學(xué)特征,包括其框架結(jié)構(gòu)有相似性,都沒(méi)有開(kāi)放閱讀框架(open reading frame, ORF),可以在所有真核生物基因組中發(fā)現(xiàn),且不能編碼蛋白質(zhì),長(zhǎng)度相似,大小約為18～22nt,是短序列小分子RNA。不同microRNA的長(zhǎng)度大約1-2個(gè)堿基變化,在3’端存在差異,一般3’端是羥基,5’端包括磷酸基團(tuán)。microRNA成熟后均為單鏈結(jié)構(gòu),上述特點(diǎn)可區(qū)分其他寡核苷酸、功能RNA的降解片段,microRNA存在于多個(gè)物種中,其序列具有高度保守性,microRNA根據(jù)基因簇而同源性有差異,同一基因簇同源性相似,否則差距較大,microRNA的表達(dá)在不同組織各自不同,稱(chēng)為組織特異性,且具有時(shí)間特異性。而一段小分子的microRNA可對(duì)多個(gè)靶基因甚至一組功能相似的靶基因?qū)崿F(xiàn)調(diào)控,因此針對(duì)microRNA選擇進(jìn)行小分子靶向治療有利于對(duì)疾病的控制,效果優(yōu)于目前臨床推廣的單基因治療方法。 隨著microRNA研究不斷深入,對(duì)于生物體內(nèi)microRNA對(duì)生物進(jìn)程的調(diào)控過(guò)程研究逐步得到認(rèn)識(shí)。目前研究認(rèn)為,microRNA是重要的調(diào)控因子,可以參與與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、代謝及凋亡、新生血管生成、細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移,包括對(duì)干細(xì)胞的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤中存在microRNA可負(fù)性調(diào)節(jié)抑癌基因,調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程從而引發(fā)腫瘤發(fā)生,或一些microRNA負(fù)性調(diào)節(jié)已知癌基因,而抑制腫瘤發(fā)生。因此不同腫瘤中miR表達(dá)及生物作用各異。尤其在膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn),microRNA表達(dá)異常并且證實(shí)參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。以往研究顯示,在膠質(zhì)瘤中表達(dá)與正常腦組織中發(fā)現(xiàn)有多種microRNA表達(dá)有明顯差異。如miR-21、miR-9-2、等表達(dá)上調(diào)；miR-128-1、miR-181a、miR-181b、miR-181c等microRNA表達(dá)下調(diào)。另有研究表明miR-10b、miR-21等11種microRNA表達(dá)下調(diào)。一方面部分MicroRNA可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲,膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯上調(diào),現(xiàn)已證實(shí)的包括miR-10-b, miR-21, miR-221/222等。另外一方面部分MicroRNA可以抑制膠質(zhì)瘤侵襲。因此以MicroRNA為靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)腫瘤診斷、治療的研究在科學(xué)研究中具有里程碑意義。 microRNA-184(miR-184)是新近研究的MicroRNA成員,目前已發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。目前已發(fā)現(xiàn)miR-184在肝癌、肺癌、鼻咽癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤等多種腫瘤中表達(dá)異常,可通過(guò)調(diào)節(jié)C-MYC和BCL2信號(hào)通路,或作為癌基因調(diào)控分子,或上調(diào)SND1信號(hào),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。但miR-184在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其具體作用機(jī)制尚未完全闡明,因此本研究擬探討miR-184對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展及增殖功能調(diào)控的影響,進(jìn)而為膠質(zhì)瘤的治療調(diào)控提供新的分子作用靶點(diǎn)。 叉頭轉(zhuǎn)錄因子Fox家族是AKT激酶的主要靶蛋白,能夠直接轉(zhuǎn)錄上調(diào)p21cip1、p27kip1,或者轉(zhuǎn)錄下調(diào)CyclinD1,起到抑制細(xì)胞增殖的作用。目前已知在哺乳動(dòng)物中,FOXO家族包括4個(gè)成員,包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6,由不同的基因編碼,并分別定位于不同的染色體上,這其中研究最多的是FOXO3a。FOXO3a的異常表達(dá),與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。其穿梭于細(xì)胞核內(nèi)外,在機(jī)體細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和抵抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。FoxO3a被AKT磷酸化可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿被泛素化,然后通過(guò)蛋白酶體途徑降解,導(dǎo)致其蛋白水平和轉(zhuǎn)錄活性降低,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。 本研究主要探討miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制,以及是否與調(diào)節(jié)FOXO3a相關(guān)。包括三個(gè)部分：第一部分：miR-184的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤不同病理級(jí)別的關(guān)系；第二部分：miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控；第三部分：miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。主要擬探討miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的表達(dá),發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制,以及是否與FOXO3a相關(guān)。 第一部分 miR-184的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤不同病理級(jí)別的關(guān)系 目的：探討miR-184的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤不同病理級(jí)別的相關(guān)性分析。 方法： 收集20例經(jīng)病理確診的不同病理分級(jí)和惡性程度的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本以及10例因腦外傷行減壓術(shù)后的天正腦組織標(biāo)本,其中5例屬于Ⅰ級(jí)腦膠質(zhì)瘤,均為毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤；4例屬于Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤,分別為原漿型星形細(xì)胞瘤1例、室管膜瘤2例、彌漫性星形細(xì)胞瘤1例；8例屬于Ⅲ級(jí)腦膠質(zhì)瘤,分別為少突膠質(zhì)瘤2例、中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤2例、間變性細(xì)胞瘤1例、間變性星形細(xì)胞瘤2例、間變性室管膜瘤1例；3例屬于Ⅳ級(jí)級(jí)腦膠質(zhì)瘤,分別為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤2例,髓母細(xì)胞瘤1例。根據(jù)WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)病理標(biāo)準(zhǔn),低惡性度膠質(zhì)瘤是Ⅰ-Ⅱ級(jí)；而Ⅲ-Ⅳ級(jí)屬于高惡性度組。提取總微小RNA；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-184基因在人腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá),并進(jìn)一步比較miR-184表達(dá)情況與不同級(jí)別膠質(zhì)瘤的相關(guān)性。利用原位雜交方法檢測(cè)miR-184在正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)變化,根據(jù)染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)判斷。 結(jié)果： 1miR-184在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中具有表達(dá),與正常腦組織的miR-184表達(dá)比較,可見(jiàn)不同級(jí)別或病理類(lèi)型膠質(zhì)瘤中miR-184表均達(dá)明顯上調(diào),二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) 2miR-184的表達(dá)上調(diào)隨著不同級(jí)別膠質(zhì)瘤而表達(dá)不同。在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中,miR-184的表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤中雖然增加,與正常腦組織比較表達(dá)上調(diào),但在早期低級(jí)別如Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而隨著惡性級(jí)別的增加,miR-184的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào),在Ⅱ-Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤中,與正常腦組織表達(dá)比較,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05；P0.01) 3miR-184在正常腦組織的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)為陰性,記分0；Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中miR-184呈弱陽(yáng)性表達(dá),記分1-2；Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中miR-184呈陽(yáng)性表達(dá),記分3-4分；Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中miR-184呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),記分6-8分；Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中miR-184同樣呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),記分6-9分；在細(xì)胞漿中miR-184陽(yáng)性信號(hào)均位于胞漿,染色程度的增加與膠質(zhì)瘤的病例級(jí)別密切相關(guān)。隨著病理級(jí)別的增加,染色也逐漸加深,且與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的類(lèi)型無(wú)關(guān)。 結(jié)論： 1miR-184在正常組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤均有表達(dá),但在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)。 2miR-184主要分布于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中。 3miR-184表達(dá)上調(diào)與膠質(zhì)瘤病例分級(jí)正相關(guān),與膠質(zhì)瘤病理類(lèi)型無(wú)關(guān)。 第二部分 miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控 目的：探討miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。 方法： Real time PCR檢測(cè)建miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、T98G、A-172、 LN18、T98G、LN229細(xì)胞中的表達(dá)；將U87和T98G各自分為三組,分別為對(duì)照組,miR-184mimic組(轉(zhuǎn)染MiR-184模擬體),MiR-184抑制劑組(轉(zhuǎn)染MiR-184抑制劑)。MTT法檢測(cè)miR-184對(duì)U87和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用；平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-184對(duì)U87和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成情況的影響；通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-184對(duì)U87和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響。 結(jié)果： 1與在組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果相似,miR-184在正常腦細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞系中均有表達(dá)。但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、U87、A-172、LN229、LN18幾種細(xì)胞系中的表達(dá)增加,與正常腦細(xì)胞NHA細(xì)胞比較,miR-184增加顯著 2當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184模擬體后,使miR-184過(guò)表達(dá),可見(jiàn)無(wú)論是在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87還是T98G細(xì)胞系中,均可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖能力；反之,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,人為抑制miR-184的表達(dá),可見(jiàn)在兩種細(xì)胞系中,腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。 3,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184模擬體后,使miR-184過(guò)表達(dá),可見(jiàn)無(wú)論是在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87還是T98G細(xì)胞系中,均可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力,與空白對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；反之,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,人為抑制miR-184的表達(dá),可見(jiàn)在兩種細(xì)胞系中,腫瘤細(xì)胞的克隆形成受到抑制,與空白對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) 4當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184模擬體后,使miR-184過(guò)表達(dá),可見(jiàn)無(wú)論是在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87還是T98G細(xì)胞系中,均可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移能力,與空白對(duì)照組比較,miR-184劃痕區(qū)長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞；反之,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,人為抑制miR-184的表達(dá),可見(jiàn)在兩種細(xì)胞系中,腫瘤細(xì)胞的遷移能力受到抑制,與空白對(duì)照組比較,miR-184劃痕區(qū)細(xì)胞明顯減少。 5空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(98.2±6.1)個(gè)；miR-184mimics對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(102.3±5.8)個(gè)；miR-184mimics轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)(115.3±11.8)個(gè)；miR-184抑制劑對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(96.6±5.3)個(gè)；miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)(35.9±4.1)個(gè),與空白對(duì)照組相比,miR-184mimics轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而miR-184mimics對(duì)照組和miR-184抑制劑對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184模擬體后,使miR-184過(guò)表達(dá),可見(jiàn)無(wú)論是在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87還是T98G細(xì)胞系中,均可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力；反之,當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,人為抑制miR-184的表達(dá),可見(jiàn)在兩種細(xì)胞系中,腫瘤細(xì)胞的侵襲能力受到抑制 結(jié)論： 1miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)增加。 2miR-184表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。 3miR-184表達(dá)上調(diào)具有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲的作用。 第三部分 miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制 目的：探討miR-184對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制。 方法： 將U87和T98G各自分為五組,分別為對(duì)照組,MiR-184mimic對(duì)照組,miR-184mimic轉(zhuǎn)染組,MiR-184抑制劑對(duì)照組MiR-184抑制劑轉(zhuǎn)染組。應(yīng)用熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-184與FOX03基因3'UTR的靶向調(diào)節(jié)作用。采用Western Blot檢測(cè)各組cyclinD1、p27、FOXO3蛋白水平表達(dá)變化。 結(jié)果： 1轉(zhuǎn)染miR-184模擬體后,含有野生型FOXO33'UTR報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性則顯著降低(P0.05)。 2轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑后,含有野生型FOX033'UTR的報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性顯著增加(P0.05)。 3轉(zhuǎn)染miR-184模擬體,U87、T98G細(xì)胞中細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)基因明顯增加(P0.05),而細(xì)胞周期抑制蛋白p27及FOXO3基因表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。 4轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑后,U87、T98G細(xì)胞中細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)基因明顯減少(P0.05),而細(xì)胞周期抑制因子p27及FOXO3基因表達(dá)明顯增加(P0.05)。 5轉(zhuǎn)染miR-184模擬體,與基因表達(dá)一致,U87、T98G細(xì)胞中細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)蛋白明顯增加(P0.05),而細(xì)胞周期抑制蛋白p27及FOXO3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。 6轉(zhuǎn)染miR-184抑制劑后,與基因表達(dá)一致,U87、T98G細(xì)胞中細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)蛋白明顯減少(P0.05),而細(xì)胞周期抑制因子p27及FOXO3蛋白表達(dá)明顯增加(P0.05)。 結(jié)論： 1miR-184通過(guò)調(diào)節(jié)FOXO3,轉(zhuǎn)錄上調(diào)CyclinD1,轉(zhuǎn)錄下調(diào)p27,促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力。 2本研究揭示了miR-184在神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、侵襲中的作用,并分析其相應(yīng)機(jī)制,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,以及可能的新的阻遏措施提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2479289