發(fā)布時(shí)間：2019-03-31 13:26

【摘要】：背景與目的 癲癇(epilepsy, EP)是腦部神經(jīng)元高度異常同步化放電所致的臨床綜合征，具有短暫性、刻板性、重復(fù)性和發(fā)作性的特點(diǎn)。長期和反復(fù)的癲癇發(fā)作不僅嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，而且還給患者家庭及社會(huì)均帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此明確癲癇的發(fā)病機(jī)制并為其治療提供新的靶點(diǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。線粒體是真核生物氧化磷酸化主要場(chǎng)所，，不僅肩負(fù)著為細(xì)胞活動(dòng)提供能量的重要作用，還在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用：線粒體的功能狀態(tài)可影響細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)、ROS(Reactive Oxygen Species, ROS)產(chǎn)生和促凋亡因子釋放，參與細(xì)胞核的信號(hào)交流并整合和放大細(xì)胞的凋亡信號(hào)，在細(xì)胞生長、衰老和凋亡等生理、病理過程中均具有關(guān)鍵作用，因此近年來線粒體成為了癲癇研究的新熱點(diǎn)。線粒體分裂蛋白抑制劑(mitochondrial division inhibitor, Mdivi-1)是一種喹唑酮類衍生物，其抑制動(dòng)力相關(guān)蛋白(dynamin-related protein1, Drp1)的作用是通過抑制三磷酸鳥苷酶(guanosine triphosphatase, GTPase)的活性發(fā)揮。最新的相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)Mdivi-1通過抑制線粒體分裂增加對(duì)心肌缺血再灌注損傷和急性腎損傷中的細(xì)胞凋亡具有顯著的保護(hù)作用。那么Mdivi-1對(duì)癲癇發(fā)作引起的海馬神經(jīng)元損傷是否具有神經(jīng)保護(hù)作用？其具體機(jī)制是什么？而目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過建議氯化鋰-匹魯卡品大鼠模型，通過觀察Mdivi-1對(duì)大鼠行為學(xué)、海馬神經(jīng)元損傷和凋亡影響，以此探討Mdivi-1對(duì)匹魯卡品(pilocarpine, PILO)致癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷中的作用，并通過凋亡相關(guān)物質(zhì)細(xì)胞色素C (cytochrome C, Cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factors, AIF)和半胱天冬酶3(caspase-3)水平變化，初步探討其可能機(jī)制。 材料與方法 88只健康雄性6-8周SD大鼠，體重在200-250g左右,隨機(jī)分為CON組、PILO組、PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組四組，每組22只。所有SD大鼠腹腔注射氯化鋰(127mg/kg)進(jìn)行預(yù)處理，20h后腹腔注射匹魯卡品(30mg/kg)，在注射匹魯卡品前30min給予氫溴酸東莨菪堿(1mg/kg)皮下注射以拮抗匹魯卡品的外周膽堿能反應(yīng)。PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組在注射匹魯卡品前30min分別給予腹腔注射Mdivi-1(1.2mg/kg)和二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）(0.1%)。對(duì)照(CON)組用等體積的生理鹽水代替匹魯卡品。癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus, SE)持續(xù)60min后腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止發(fā)作。以Racine癇性發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為判定標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)Ⅳ或Ⅴ級(jí)定為癲癇模型制作成功。分別記錄各組大鼠致癇成功率及潛伏期。造模成功后各組一半大鼠在SE后72h麻醉后灌注取腦，采用尼氏染色法和TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元損傷和凋亡情況，剩余大鼠在SE后24h麻醉后斷頭取腦，分離出雙側(cè)海馬，采用Western blot法檢測(cè)Drp1、Cyt C、AIF和caspase-3表達(dá)水平，RT-PCR法檢測(cè)Drp1mRNA水平。 結(jié)果 1.行為學(xué)觀察：CON組大鼠無癇性發(fā)作，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組大鼠有癇性發(fā)作，最高可達(dá)Ⅳ-Ⅴ級(jí)，各組大鼠造模成功率和發(fā)作潛伏期之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.病理學(xué)檢測(cè)：Nissl染色結(jié)果顯示與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠海馬神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷，神經(jīng)元數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組海馬神經(jīng)元數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PILO+DMSO組海馬神經(jīng)元數(shù)目減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TUNEL法結(jié)果顯示與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PILO+DMSO組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)目增多，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3. Western blot結(jié)果：與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠在SE后24h海馬組織內(nèi)Drp1水平顯著升高，Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組Drp1水平降低，PILO+DMSO組Drp1水平升高，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； PILO+Mdivi-1組Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PILO+DMSO組Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活增多，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4. RT-PCR結(jié)果：與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠在SE后24h海馬組織內(nèi)Drp1mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組Drp1mRNA水平降低，PILO+DMSO組Drp1mRNA水平升高，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1. SE發(fā)作后海馬神經(jīng)元內(nèi)Drp1及Drp1mRNA增加，證明線粒體分裂增加參與癲癇病理損傷過程； 2. Mdivi-1對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活有關(guān)； 3.抑制線粒體分裂可成為抗癲癇治療的新思路和方法。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉立棟;程錦;張榮慶;曾超;王瑾懿;喻秋s

本文編號(hào)：2450944