【摘要】：背景與目的 癲癇(epilepsy, EP)是腦部神經元高度異常同步化放電所致的臨床綜合征，具有短暫性、刻板性、重復性和發(fā)作性的特點。長期和反復的癲癇發(fā)作不僅嚴重降低了患者的生活質量，而且還給患者家庭及社會均帶來沉重的經濟負擔，因此明確癲癇的發(fā)病機制并為其治療提供新的靶點具有重要的現(xiàn)實意義。線粒體是真核生物氧化磷酸化主要場所，不僅肩負著為細胞活動提供能量的重要作用，還在細胞信號傳導中發(fā)揮著重要作用：線粒體的功能狀態(tài)可影響細胞內鈣信號傳導、ROS(Reactive Oxygen Species, ROS)產生和促凋亡因子釋放，參與細胞核的信號交流并整合和放大細胞的凋亡信號，在細胞生長、衰老和凋亡等生理、病理過程中均具有關鍵作用，因此近年來線粒體成為了癲癇研究的新熱點。線粒體分裂蛋白抑制劑(mitochondrial division inhibitor, Mdivi-1)是一種喹唑酮類衍生物，其抑制動力相關蛋白(dynamin-related protein1, Drp1)的作用是通過抑制三磷酸鳥苷酶(guanosine triphosphatase, GTPase)的活性發(fā)揮。最新的相關研究已經證實Mdivi-1通過抑制線粒體分裂增加對心肌缺血再灌注損傷和急性腎損傷中的細胞凋亡具有顯著的保護作用。那么Mdivi-1對癲癇發(fā)作引起的海馬神經元損傷是否具有神經保護作用？其具體機制是什么？而目前國內外尚未見有關研究。因此，，本實驗擬通過建議氯化鋰-匹魯卡品大鼠模型，通過觀察Mdivi-1對大鼠行為學、海馬神經元損傷和凋亡影響，以此探討Mdivi-1對匹魯卡品(pilocarpine, PILO)致癇大鼠海馬神經元損傷中的作用，并通過凋亡相關物質細胞色素C (cytochrome C, Cyt C)、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factors, AIF)和半胱天冬酶3(caspase-3)水平變化，初步探討其可能機制。 材料與方法 88只健康雄性6-8周SD大鼠，體重在200-250g左右,隨機分為CON組、PILO組、PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組四組，每組22只。所有SD大鼠腹腔注射氯化鋰(127mg/kg)進行預處理，20h后腹腔注射匹魯卡品(30mg/kg)，在注射匹魯卡品前30min給予氫溴酸東莨菪堿(1mg/kg)皮下注射以拮抗匹魯卡品的外周膽堿能反應。PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組在注射匹魯卡品前30min分別給予腹腔注射Mdivi-1(1.2mg/kg)和二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）(0.1%)。對照(CON)組用等體積的生理鹽水代替匹魯卡品。癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus, SE)持續(xù)60min后腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止發(fā)作。以Racine癇性發(fā)作分級標準為判定標準，達Ⅳ或Ⅴ級定為癲癇模型制作成功。分別記錄各組大鼠致癇成功率及潛伏期。造模成功后各組一半大鼠在SE后72h麻醉后灌注取腦，采用尼氏染色法和TUNEL法檢測神經元損傷和凋亡情況，剩余大鼠在SE后24h麻醉后斷頭取腦，分離出雙側海馬，采用Western blot法檢測Drp1、Cyt C、AIF和caspase-3表達水平，RT-PCR法檢測Drp1mRNA水平。 結果 1.行為學觀察：CON組大鼠無癇性發(fā)作，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組大鼠有癇性發(fā)作，最高可達Ⅳ-Ⅴ級，各組大鼠造模成功率和發(fā)作潛伏期之間差異均無統(tǒng)計學意義。 2.病理學檢測：Nissl染色結果顯示與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠海馬神經元出現(xiàn)明顯損傷，神經元數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組海馬神經元數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計學意義，PILO+DMSO組海馬神經元數(shù)目減少，但無統(tǒng)計學意義。TUNEL法結果顯示與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠海馬神經元凋亡數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計學意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組海馬神經元凋亡數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義，PILO+DMSO組海馬神經元凋亡數(shù)目增多，差異無統(tǒng)計學意義。 3. Western blot結果：與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠在SE后24h海馬組織內Drp1水平顯著升高，Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組Drp1水平降低，PILO+DMSO組Drp1水平升高，差異均無統(tǒng)計學意義； PILO+Mdivi-1組Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活減少，差異均有統(tǒng)計學意義，PILO+DMSO組Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活增多，差異均無統(tǒng)計學意義。 4. RT-PCR結果：與CON組相比，PILO組、PILO+Mdivi-1組和PILO+DMSO組三組大鼠在SE后24h海馬組織內Drp1mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義；與PILO組相比，PILO+Mdivi-1組Drp1mRNA水平降低，PILO+DMSO組Drp1mRNA水平升高，差異均無統(tǒng)計學意義。 結論 1. SE發(fā)作后海馬神經元內Drp1及Drp1mRNA增加，證明線粒體分裂增加參與癲癇病理損傷過程； 2. Mdivi-1對癲癇大鼠海馬神經元有神經保護作用，其機制可能與抑制Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活有關； 3.抑制線粒體分裂可成為抗癲癇治療的新思路和方法。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

【參考文獻】

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1 劉立棟;程錦;張榮慶;曾超;王瑾懿;喻秋s

本文編號：2450943