【摘要】：缺血性腦卒中是指由于腦的供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死,是全世界范圍內(nèi)主要的致死和致殘?jiān)蛑?給公眾健康和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。隨著人口老齡化的加劇,缺血性腦卒中將成為日益嚴(yán)峻的社會(huì)問(wèn)題。提高對(duì)缺血性腦卒中的診斷與治療水平,降低腦卒中的死亡率和致殘率是當(dāng)務(wù)之急。因此,為缺血性腦卒中探索更多新的輔助診斷、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)或治療靶點(diǎn)具有重大現(xiàn)實(shí)意義。最初的研究發(fā)現(xiàn)小鼠成對(duì)免疫球蛋白樣受體B(paired immunoglobulin-like receptor B,PirB)是一種重要的免疫分子,后續(xù)越來(lái)越多的研究表明PirB分子不但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)上有所表達(dá),而且在突觸可塑性以及軸突再生等過(guò)程中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。研究己經(jīng)證實(shí)PirB分子的缺失有利于小鼠缺血再灌注腦卒中模型的恢復(fù),在再灌注第7天PirB蛋白在損傷半腦的表達(dá)顯著升高。然而,PirB分子在缺血性腦卒中的時(shí)空特異性表達(dá)還未完善,以及基于PirB分子為靶點(diǎn)的缺血性腦卒中分子成像和分子治療的研究未見報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)使用了線栓法制備小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型,光化學(xué)法誘導(dǎo)小鼠大腦皮質(zhì)終末動(dòng)脈阻塞模型和小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型這三種不同的體內(nèi)缺血性腦卒中模型,以及使用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元構(gòu)建的氧糖剝奪的體外模型,圍繞PirB分子開展研究,獲得如下結(jié)果:1.在線栓法制備的缺血再灌注腦卒中模型中,損傷部位主要位于紋狀體、皮層和海馬。從再灌注24h開始,缺血半腦PirB mRNA的表達(dá)比對(duì)側(cè)半腦顯著增高,其中在海馬部位的上調(diào)變化最明顯。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示PirB蛋白在缺血側(cè)與對(duì)側(cè)相比,表達(dá)的強(qiáng)度和廣度都有增加,并且與NeuN陽(yáng)性的神經(jīng)元共標(biāo)。在細(xì)胞非破膜狀態(tài)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察NeuN陽(yáng)性的神經(jīng)元中PirB陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例,結(jié)果顯示缺血同側(cè)PirB陽(yáng)性的神經(jīng)元比例顯著高于對(duì)側(cè)。同時(shí),缺血側(cè)PirB的配體分子經(jīng)典MHC Ⅰ類分子表達(dá)顯著升高,PirB磷酸化水平在再灌注24h后也顯著增加,表明缺血再灌注損傷后PirB介導(dǎo)的下游信號(hào)通路活化水平增加。2.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot定量分析光化學(xué)法誘導(dǎo)的缺血性腦卒中模型中PirB分子的表達(dá)變化。在光化學(xué)法大腦中動(dòng)脈阻塞卒中模型缺血24h,缺血損傷側(cè)與對(duì)側(cè)相比,PirB mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高。在大腦皮質(zhì)終末動(dòng)脈阻塞卒中模型缺血3day、7day和14day后,缺血損傷側(cè)與對(duì)側(cè)相比,PirB mRNA和蛋白的表達(dá)都顯著升高。缺血3day時(shí),PirB分子的病理性升高達(dá)到峰值,隨后逐漸降低。并且,PirB分子的上調(diào)變化趨勢(shì)與缺血損傷的面積呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明缺血損傷能顯著誘導(dǎo)PirB分子的上調(diào)表達(dá)。3.基于抗PirB胞外段的6C1抗體構(gòu)建的荷載近紅外熒光染料的免疫脂質(zhì)體納米探針,尺寸為150nm左右,外觀圓整,粒徑均一,分散性好�？筆irB免疫脂質(zhì)體納米探針在體外細(xì)胞水平表現(xiàn)出對(duì)PirB分子良好的靶向性和特異性,在體內(nèi)缺血性腦卒中模型中具有較好的近紅外熒光成像性能和體內(nèi)缺血腦組織靶向性。在大腦皮質(zhì)終末動(dòng)脈阻塞卒中模型缺血48h后,經(jīng)尾靜脈注射近紅外熒光納米探針后,在4h-24h時(shí)間段,靶向免疫脂質(zhì)體納米探針在腦缺血部位的近紅外熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于非靶向納米脂質(zhì)體探針,該時(shí)段為PirB分子病理性升高達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn),結(jié)果充分表明了抗PirB免疫脂質(zhì)體納米探針能在大腦皮質(zhì)終末動(dòng)脈阻塞卒中模型中很好的靶向病理性上調(diào)表達(dá)的PirB分子。4.在皮層神經(jīng)元氧糖剝奪模型中(oxygen glucose deprivation,OGD),OGD組與對(duì)照組相比,PirB分子及其配體H2-Kb和H2-Db分子的表達(dá)在復(fù)氧復(fù)糖12h和24h后顯著升高,其中PirB分子表達(dá)上調(diào)幅度最大。在復(fù)氧復(fù)糖時(shí)通過(guò)外源加入可溶性PirB胞外段全長(zhǎng)蛋白(sPirB)來(lái)阻斷內(nèi)源性PirB與其配體的結(jié)合,能顯著降低OGD后神經(jīng)元凋亡的水平,減少細(xì)胞凋亡發(fā)生。經(jīng)長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體遞送的sPirB能在小鼠大腦皮質(zhì)終末動(dòng)脈阻塞模型缺血急性期,促進(jìn)損傷面積和運(yùn)動(dòng)行為能力的恢復(fù)。5.以PirB分子的人同源蛋白LILRB2為靶蛋白進(jìn)行噬菌體展示十二肽庫(kù)篩選,經(jīng)過(guò)三輪親和篩選后,噬菌體洗脫液滴度富集了 856倍,表明與LILRB2蛋白特異性結(jié)合的噬菌體克隆獲得理想富集。噬菌體-肽克隆測(cè)序分析結(jié)果顯示LBP-1肽段占?jí)旱剐詢?yōu)勢(shì),占83.8%。進(jìn)一步通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)證明LBP-1噬菌體-肽特異性的與LILRB2和PirB的胞外段結(jié)合。以上結(jié)果進(jìn)一步闡明了神經(jīng)元PirB分子在不同類型缺血性腦卒中模型中的表達(dá)情況,表明PirB分子在缺血損傷后病理性上調(diào)表達(dá),是缺血性腦卒中疾病進(jìn)程中的重要分子。并且,PirB的上調(diào)變化程度與缺血損傷面積呈正相關(guān),且不利于損傷后的恢復(fù)。因此,PirB分子有望作為缺血性腦卒中診斷和分子治療的靶標(biāo)。我們構(gòu)建的抗PirB免疫脂質(zhì)體納米探針,具有較好的近紅外熒光成像性能和體內(nèi)缺血腦組織靶向性;sPirB在缺血性腦卒中體內(nèi)模型中,具有較好的治療效果;通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)篩選到與PirB分子及其人同源蛋白都結(jié)合的多肽序列,有望推進(jìn)以PirB為成像和治療靶點(diǎn)的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。本課題的研究結(jié)果為PirB分子作為缺血性腦卒中的診療靶標(biāo)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),進(jìn)一步解析了缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)理和恢復(fù)進(jìn)程,并有利于實(shí)現(xiàn)在真實(shí)環(huán)境下以PirB分子為靶標(biāo)的治療效果的直觀可視化,具有重要現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：2433406