【摘要】：目的： 神經(jīng)遞質(zhì)對于哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的功能起著重要的介導(dǎo)作用,也參與維系腦部血液的循環(huán)。病理情況下神經(jīng)遞質(zhì)與腦血管病、顱腦外傷密切相關(guān),甚至影響腦的繼發(fā)性病變。腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)的測定對于了解神經(jīng)遞質(zhì)在中樞系統(tǒng)的作用和對中樞系統(tǒng)疾病的診斷及發(fā)病機(jī)理的研究都具有重要意義。本文在一些已有的研究的基礎(chǔ)上,對方法進(jìn)行改進(jìn),建立了一種采用NBD-F對氨基酸樣品進(jìn)行柱前衍生,應(yīng)用高效液相色譜儀熒光檢測器(HPLC-FLD)進(jìn)行檢測的方法,利用這種方法對病毒性腦炎患者、化膿性腦炎患者、腦瘤患者、蛛網(wǎng)膜下腔出血患者和急性淋巴細(xì)胞白血病患者腦脊液中的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、�；撬�(Tau)、甘氨酸(Gly)和Y-氨基丁酸(GABA)5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行測定,并參照文獻(xiàn)記載方法測定上述患者腦脊液中的去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì),探討腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)的水平與疾病的關(guān)系,為疾病的診斷和鑒別診斷提供理論依據(jù)。 方法： 1.腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的測定方法 1.1樣品處理 樣品離心沉淀蛋白后準(zhǔn)確量取100μL上清液于1.5mL離心管中,依次加入200μL乙腈,175μL pH9.5硼酸緩沖液,密封混勻后加入25μL0.1mol/LNBD-F使用液,混勻,于60℃水浴中避光反應(yīng)7min后取出,冷卻至室溫,采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)檢測。 1.2色譜條件 色譜柱：SHIMADZU shim-pack VP-ODS250×4.6mm,5μm；柱溫30℃；流動相：乙腈-磷酸緩沖鹽溶液(0.02mol/L,pH6.0；16:84,v/v)；流速1.0mL/min;激發(fā)波長475nm,發(fā)射波長536nm;進(jìn)樣量10μ。 2.腦脊液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定方法 2.1樣品處理 樣品離心沉淀蛋白后取上清,采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)檢測。 2.2色譜條件 色譜柱：SHIMADZU shim-pack VP-ODS250×4.6mm,5μm柱溫30℃：流動相：甲醇-醋酸鈉溶液(0.1mol/L,醋酸調(diào)pH2.5-3；2：98,v/v)；流速1.2mL/min;熒光激發(fā)波長280nm,發(fā)射波長314nm；進(jìn)樣量10μL。 結(jié)果： 1.腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的測定結(jié)果 1.1氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)測定的方法學(xué)研究 在給定的條件下,腦脊液中5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在15min內(nèi)分離完全且分離良好,5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在0.1～100μamol/L范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(r0.999)。 Asp:Y=25918X+3517(r=0.9998),最低檢出濃度為2.34×10-3μmol/L,加標(biāo)回收率為98.3%、102.2%和96.6%,日內(nèi)精密度RSD為2.7%、3.6%和4.2%,日間精密度RSD為4.8%、4.6%和3.9%。 Glu:Y=17397X+1952(r=0.9999),最低檢出濃度為1.78×10-3μmol/L,加標(biāo)回收率為98.2%、94.7%和102.7%,日內(nèi)精密度RSD為3.8%、2.9%和4.4%,日間精密度RSD為5.6%、4.2%和3.7%。 Gly:Y=28913X+2074(r=0.9997),最低檢出濃度為8.33×10-3μmol/L,加標(biāo)回收率為99.4%、105.2%和102.7%,日內(nèi)精密度RSD為4.2%、3.4%和4.6%,日間精密度RSD為5.2%、4.8%和5.1%。 Tau:Y=36726X+6736(r=0.9995),最低檢出濃度為5.75×10-3μmol/L,加標(biāo)回收率為96.3%、98.6%和104.5%,日內(nèi)精密度RSD為3.4%、2.9%和4.1%,日間精密度RSD為4.7%、5.6%和5.2%。 GABA:Y=19475X+3638(r=0.9998),最低檢出濃度為7.26×10-3μmol/L,加標(biāo)回收率為106.1%、97.3%和99.6%,日內(nèi)精密度RSD為3.1%、3.6%和4.7%,日間精密度RSD為4.2%、6.0%和4.3%。 1.2腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)與疾病的關(guān)系 病毒性腦炎患者腦脊液中Glu、Gly、Tau的含量顯著高于對照組(P0.05),化膿性腦炎患者腦脊液中Asp、Glu、Gly、Tau的含量顯著高于對照組(P0.05),低。 蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液中Asp、Glu、Gly、Tau、GABA的含量均明顯高于對照組(P0.05)。 腦瘤患者腦脊液中Asp、Gly的含量明顯低于對照組(P0.05)。 急性淋巴細(xì)胞白血病患者腦脊液中Glu、Gly的含量顯著高于對照組(P0.05)。 2.腦脊液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定結(jié)果 1.1單胺類神經(jīng)遞質(zhì)測定的方法學(xué)研究 在給定的條件下,腦脊液中4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在20min內(nèi)分離完全且分離良好,4種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在0.02～10μmol/L范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(r0.999)。 NE:Y=77573X+5638(r=0.9997),最低檢出濃度為3.67×10-4μmol/L,加標(biāo)回收率為97.8%、98.2%和103.6%,日內(nèi)精密度RSD為3.2%、2.6%和4.3%,日間精密度RSD為4.7%、4.9%和3.8%。 E:Y=173671X+7663(r=0.9999),最低檢出濃度為2.16×10-4μmol/L,加標(biāo)回收率為104.2%、99.8%和98.6%,日內(nèi)精密度RSD為4.1%、3.9%和3.4%,日間精密度RSD為4.5%、5.2%和3.7%。 DA:Y=55632X+224(r=00.9997),最低檢出濃度為7.87×10-4μmol/L,加標(biāo)回收率為103.4%、97.2%和102.5%,日內(nèi)精密度RSD為4.5%、3.1%和4.2%,日間精密度RSD為5.0%、4.6%和4.8%。 5-HT:Y=98126X+5633(r=0.9996),最低檢出濃度為4.29×10-4μmol/L,加標(biāo)回收率為99.1%、105.6%和97.4%,日內(nèi)精密度RSD為3.8%、4.9%和4.7%,日間精密度RSD為5.6%、4.5%和5.3%。 1.2腦脊液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與疾病的關(guān)系 病毒性腦炎患者腦脊液中5-HT的含量顯著低于對照組(P0.05),化膿性腦炎患者腦脊液中5-HT的含量顯著高于對照組(P0.05)。 蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液中NE含量均明顯高于對照組(P0.05),5-HT的含量顯著低于對照組(P0.05)。 腦瘤患者腦脊液中NE含量均明顯低于對照組(P0.05),5-HT的含量顯著高于對照組(P0.05)。 結(jié)論 1. NBD-F對氨基酸樣品進(jìn)行柱前衍生,高效液相色譜儀熒光檢測器(HPLC-FLD)進(jìn)行檢測的方法分離效果好,靈敏度高,準(zhǔn)確度好,結(jié)果可靠,適合腦脊液中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的的測定。 2.檢測腦炎患者腦脊液中的氨基酸有助于腦炎的診斷,利用氨基酸和5-HT在腦脊液中的不同改變對則鑒別病毒性腦炎及化膿性腦炎具有一定的意義。 3.檢測分析蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液中興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)可為疾病的早期診斷及治療提供相應(yīng)的參考依據(jù)。 4.研究腦瘤患者腦脊液中氨基酸和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化有助于探討癌細(xì)胞的代謝,可為腦瘤的治療提供一定的線索。 5.檢測急性淋巴細(xì)胞白血病患者腦脊液中的氨基酸水平可以為白血病患者氨基酸療法提供可靠的依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2432596