【摘要】：膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,其占原發(fā)性腦腫瘤的35.26-60.96%(平均44.69%)。該腫瘤發(fā)展快,且呈浸潤性生長,手術難于完全切除；同時,該腫瘤還具有對放療和化療耐受的特點,這些因素導致膠質瘤治療后易復發(fā),極大地威脅著患者的生命。盡管神經外科手術技術和放化療技術都不斷提高,但并沒能顯著改善腦膠質瘤患者的預后(平均生存期僅為12.6個月)。傳統(tǒng)觀點認為,膠質瘤細胞均具有無限增殖能力,但近年來研究發(fā)現,腫瘤中僅有小部分細胞具自我更新、無限增殖、多向分化潛能及致瘤的特性,這部分細胞被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC),而其它大部分腫瘤細胞則僅具備短暫的增殖能力。到目前為止,人們已成功從消化系統(tǒng)腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤、泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤、腦腫瘤、乳腺癌腫瘤、皮膚腫瘤等腫瘤中分離出了各自的腫瘤干細胞。研究者將腦膠質瘤中的腫瘤干細胞稱之為膠質瘤干細胞(Glioma stem cells, GSCs)。 膠質瘤是異質化的腫瘤,即膠質瘤中腫瘤細胞存在等級效應,不同等級的細胞在分化程度、侵襲能力、增殖能力、對化療或放療的敏感性等方面均有所不同。經過手術、化療、放療等治療后,絕大多數膠質瘤細胞被殺死,而膠質瘤干細胞因高表達多種抗凋亡基因和耐藥基因而得以殘留,為膠質瘤復發(fā)的提供可能。因此,多數學者認為膠質瘤干細胞可能是膠質瘤起始、復發(fā)、轉移和放化療抵抗的根本原因�；谝陨嫌^點,探究膠質瘤干細胞生存和增殖的分子機制,尋求抑制膠質瘤干細胞生存和惡性增殖的靶點,對膠質瘤的根除性治療極為重要。 缺氧是膠質瘤細胞生存微環(huán)境中最常見的特征,膠質瘤臨床標本中經�？梢妵乐厝毖鯇е碌哪[瘤性壞死。然而,膠質瘤干細胞卻能耐受這種腫瘤性缺氧；同時,缺氧能阻斷腫瘤干細胞分化并且促進其增殖。因此,對膠質瘤干細胞增殖的研究應當在缺氧的環(huán)境中進行。研究發(fā)現,在缺氧應激下,普通腫瘤細胞功能紊亂,ATP和AMP等分子會被釋放到細胞外。這些分子在細胞外具有抗腫瘤效應,能抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。然而,外核苷酶能將胞外ATP和AMP分子水解并生成腺苷；胞外的腺苷是一種組織保護因子,能促進血管生成、減少放療損傷和缺血再灌注損傷。膠質瘤臨床組織微環(huán)境的研究發(fā)現,膠質瘤干細胞生存的缺氧微環(huán)境中腺苷濃度比腫瘤周邊區(qū)高出100倍以上。因此,膠質瘤干細胞可能表達一種外核苷酶,將胞外不利的ATP和AMP分子轉化為有利的腺苷分子,借此在腫瘤性缺氧微環(huán)境中生存和增殖。 CD73和前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase, PAP)是目前發(fā)現的兩種外核苷酶。CD73表達在黑色素瘤、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤細胞中,其通過產生腺苷對腫瘤細胞的增殖具有促進作用；然而,CD73在腫瘤干細胞中表達情況尚未見報道。PAP最早被發(fā)現在前列腺組織中表達,然而其功能不詳。近年,研究發(fā)現PAP表達在脊髓背根疼痛性神經元中,其具有外核苷酶活性能生成腺苷刺激下游通路緩解疼痛；然而,PAP在腫瘤干細胞中表達情況也未見報道。本研究小組在前期實驗中發(fā)現PAP高表達于缺氧的膠質瘤干細胞中。本實驗擬探究PAP在腦膠質瘤干細胞中的表達模式,探討其在腦膠質瘤干細胞的作用及作用機制,為膠質瘤的治療提供新的思路。 第一部分膠質瘤干細胞系的構建 目的：利用改良的功能性純化方法從原代膠質母細胞瘤組織細胞、膠質母細胞瘤細胞系細胞中培養(yǎng)、純化膠質瘤干細胞,并建立腫瘤干細胞細胞系。 方法：選擇人原代膠質母細胞瘤組織細胞GL1和人膠質母細胞瘤細胞系細胞U87,應用無血清干細胞培養(yǎng)基(stem cell medium, SCM.內含DMEM/F12+40ng/mL bFGF+40ng/mL EGF+4%B27)培養(yǎng),通過缺氧下地細胞濃度懸浮腫瘤球培養(yǎng)并連續(xù)傳代的功能性純化方法,從人原代膠質母細胞瘤組織細胞GLl和人膠質母細胞瘤細胞系細胞U87中培養(yǎng)、純化,獲得第五代腫瘤球；對第五代腫瘤球細胞的一般形態(tài)、細胞活性、干性標記物、自我更新能力、多向分化能力進行觀察鑒定,構建膠質瘤干細胞系。 結果：低細胞密度的U87和GL1膠質瘤細胞在缺氧下無血清干細胞培養(yǎng)基中有懸浮生長的腫瘤球形成；并且,這些腫瘤球還能連續(xù)傳代增殖成腫瘤球。隨機選擇的10個第五代腫瘤球切片中,CD133陽性細胞平均占95%,Nestin陽性細胞平均占89%。第五代腫瘤球細胞在Matrigel包被培養(yǎng)板上顯示貼壁特性,在無Matrigel包被的培養(yǎng)板上顯示再成球特性。在含血清培養(yǎng)基中第五代腫瘤球細胞能迅速貼壁并從腫瘤球中爬出；爬出的細胞在無血清干細胞培養(yǎng)基中又能增殖成腫瘤球。添加血清后第五代腫瘤球細胞能分化為表達神經元(βⅢ-Tublin)、星形膠質細胞(GFAP)和少突膠質細胞(01)的子代腫瘤細胞。 結論：人膠質瘤細胞系U87和人膠質瘤組織GL1中存在具無限增殖、自我更新及多向分化潛能的腫瘤干細胞。利用缺氧下功能性純化方法培養(yǎng)出的第五代腫瘤球細胞具有表達腫瘤干細胞標記物特性、無線增殖能力、自我更新能力和多系分化能力,符合膠質瘤干細胞的特征；此外,這些細胞還具有良好的細胞活力,并且在Matrigel包被培養(yǎng)板上顯示貼壁特性。因此,Matrigel中貼壁生長的U87和GL1來源的第五代腫瘤球細胞可被用作膠質瘤干細胞系(分別為U87GSC和GL1GSC)。 第二部分PAP的表達和缺氧對PAP的調控 目的：比較缺氧或生理氧培養(yǎng)下的普通膠質瘤細胞和膠質瘤干細胞中PAP或CD73的表達情況,并探索缺氧對PAP的調控作用。 方法：用Western blot和QRT-PCR檢測并比較缺氧或生理氧下U87和U87GSC中PAP和CD73蛋白及mRNA的表達情況。用Western blot和QRT-PCR進一步比較缺氧或生理氧下人非腫瘤腦組織細胞NT1、人膠質瘤細胞系U87和人膠質瘤臨床組織來源細胞GL1中PAP蛋白及mRNA的水平,同時比較缺氧或生理氧下人神經干細胞NT1NSC、細胞系來源人膠質瘤干細胞U87GSC和臨床膠質瘤組織來源膠質瘤干細胞GL1GSC中PAP蛋白及mRNA的水平。 用Western blot和QRT-PCR檢測并比較HIF1a、 HIF2a和PAP在U87和U87GSC四個缺氧時間點(Oh,12h,24h,48h)中的表達情況,借此推斷HIF1a和HIF2a兩者中哪一個與PAP表達模式最密切。然后,依次干擾HIF1a或HIF2a的表達,觀察膠質瘤干細胞增殖能力的變化；同時檢測干擾后PAP表達量的變化,借此判斷HIF1a和HIF2a兩者中哪一個可能參與調節(jié)PAP的表達。 結果：CD73在U87和U87GSC中表達極弱。PAP在非腫瘤腦組織細胞(NT1)、神經干細胞(NTINSC)和膠質瘤細胞(GL1及U87)中的表達極弱；而PAP在膠質瘤干細胞(GL1GSC、U87GSC)中呈中等量表達,且缺氧對其表達有促進作用(P0.01)。 Western blot和QRT-PCR檢測結果表明,在U87細胞中,隨著缺氧時間的延長,HIF1a表達量在逐漸升高；而HIF2a和PAP起始表達量極低且缺氧后變化不明顯；在U87GSC細胞中,HIF2a和PAP起始表達量高且隨著缺氧時間的延長兩者的表達量明顯升高,而HIF1a表達量隨著缺氧時間的延長升高不明顯。腫瘤球切片的免疫組化染色實驗也發(fā)現,U87GSC來源腫瘤球缺氧后PAP和HIF2a的蛋白表達量均升高。RNAi實驗發(fā)現,干擾HIF1a的表達對U87GSC和GL1GSC細胞來源腫瘤球的生長并無影響；然而,干擾HIF2a的表達明顯降低U87GSC和GL1GSC細胞來源腫瘤球的生長體積。此外,干擾HIF1a的表達并不影響缺氧下膠質瘤干細胞中PAP的表達,而干擾HIF2a卻明顯降低缺氧下膠質瘤干細胞中PAP的表達量。 結論：CD73在普通膠質瘤細胞和膠質瘤干細胞中幾乎不表達；而PAP表達在膠質瘤干細胞上,且其表達受缺氧影響。缺氧下膠質瘤干細胞中HIF2a和PAP的表達具有同向性。缺氧對膠質瘤干細胞的促增殖作用是通過HIF2a實現的。缺氧的膠質瘤干細胞中HIF2a對PAP的表達有上調作用。 第三部分PAP的功能及其機制 目的：探索PAP在膠質瘤干細胞上的功能及其機制 方法：利用RNAi技術干擾膠質瘤干細胞中PAP的表達,并通過Western blot實驗驗證干擾效果。利用高效液相質譜檢測并比較U87GSC和GL1GSC細胞的AMP添加組、AMP未添加組和AMP添加同時干擾PAP表達組中細胞外液的腺苷濃度。利用腫瘤球形成實驗檢測U87GSC和GL1GSC細胞的PAP干擾組、PAP干擾同時添加腺苷組、腺苷添加組、對照組在缺氧下形成腫瘤球的數量和體積。利用有限稀釋法檢測缺氧下U87GSC和GL1GSC細胞4個細胞組細胞在96孔板中不同細胞密度下是否形成腫瘤球,并以此作圖計算出各組理論上形成一個腫瘤球所需細胞數量。利用熒光標記流式細胞儀檢測4個細胞組的細胞周期并通過公式SPF (S-phase cell fraction)=S/(GO/G1+S+G2/M)計算出各組細胞的增殖指數。利用裸鼠皮下成瘤法,檢測U87來源膠質瘤干細胞的PAP干擾組、PAP干擾同時添加腺苷組、腺苷添加組、對照組在體內形成腫瘤情況,每5日測量腫瘤體積并依據時間點繪出腫瘤的增殖曲線。 利用QRT-PCR技術檢測缺氧下4類腺苷受體(A1、A2A、A2B、A3)在U87GSC和GL1GSC細胞中的表達情況,判斷在膠質瘤干細胞中哪些腺苷受體可能與膠質瘤干細胞的增殖相關。在U87GSC和GL1GSC細胞中,分別干擾A2B和A3腺苷受體的表達,并用QRT-PCR技術檢測干擾效果。分別將U87GSC和GL1GSC分為五個細胞組(對照組、A2B受體干擾組、A3受體干擾組、A2B受體化學阻斷組、A3受體化學阻斷組),分別將各組細胞用于腫瘤球形成實驗,觀測并記錄各組形成的腫瘤球細胞數量和體積,并通過統(tǒng)計學比較各組間數量和體積的差異。利用Western blot技術檢測缺氧下U87GSC四個細胞組(腺苷添加組、PAP干擾同時添加腺苷組、PAP干擾組、對照組)磷酸化及非磷酸化Akt、Erk、JNK的表達情況,判斷四個細胞組分別激活了哪條些通路。然后,再利用Western blot技術檢測缺氧下U87GSC五個細胞組(對照組、A2B受體干擾組、A3受體干擾組、A2B受體化學阻斷組、A3受體化學阻斷組)中磷酸化及非磷酸化Akt、Erk的表達情況,判斷這兩條通路的激活是被A3和A2B腺苷受體中的哪個刺激所引起。 結果：Western blot實驗發(fā)現,干擾PAP表達后,PAP的表達量明顯降低。缺氧24h后,添加AMP的U87GSC和GL1GSC細胞組中胞外腺苷的濃度明顯高于相應的未添加組。此外,在添加組中干擾PAP的表達會明顯降低細胞外液中腺苷濃度。 在腫瘤球形成實驗中,干擾PAP的表達導致U87GSC和GL1GSC細胞形成腫瘤球的數量和體積明顯減少；而干擾PAP表達同時添加腺苷能明顯抑制這種現象；此外,單純添加腺苷還能明顯增加形成腫瘤球的數量和體積。有限稀釋法實驗發(fā)現,干擾PAP的表達導致U87GSC和GL1GSC細胞理論上需要更多的數量才能形成一個腫瘤球；而干擾PAP表達同時添加腺苷能明顯抑制這種現象；此外,單純添加腺苷還能明顯減少理論上形成一個腫瘤球所需的細胞數量。細胞周期檢測發(fā)現,干擾PAP的表達導致U87GSC和GL1GSC細胞的增殖指數(the S-phase cell fraction, SPF)顯著下降,而同時添加腺苷卻能抑制這一現象；單純添加腺苷能明顯升高細胞增殖指數。 裸鼠成瘤實驗表明,干擾PAP的表達明顯抑制U87GSC來源膠質瘤的生長速度,而腺苷的添加則顯著提高該腫瘤的生長速度。 QRT-PCR實驗發(fā)現,缺氧下U87GSC和GL1GSC細胞表達A2B和A3腺苷受體,而不表達A1和A2A腺苷受體。干擾A2B和A3腺苷受體后,兩者的表達量顯著降低。A3腺苷受體表達的干擾或化學阻斷均不能影響U87GSC和GL1GSC細胞來源腫瘤球的成球率(腫瘤球數量數量)和生長速度(腫瘤球體積)。然而,A2B腺苷受體表達的干擾或化學阻斷均導致U87GSC和GL1GSC細胞來源腫瘤球的生長速度明顯減慢,成球率也明顯降低。 干擾PAP的表達或添加腺苷對JNK的磷酸化沒有影響。干擾PAP的表達使Akt和Erk-1/2的磷酸化水平顯著降低；而單純添加腺苷則使Akt和Erk-1/2磷酸化水平顯著升高。A3腺苷受體表達的干擾或化學阻斷均不影響U87GSC中Akt和Erk-1/2的磷酸化水平。然而,A2B腺苷受體表達的干擾或化學阻斷卻均能導致U87GSC細胞中Akt和Erk-1/2的磷酸化水平明顯降低。 結論：PAP具有外核苷酶活性,能將胞外AMP轉化為胞外腺苷。體內實驗表明,PAP通過生成腺苷能促進膠質瘤干細胞增殖并形成腫瘤球；外實驗表明,PAP通過生成腺苷對膠質瘤干細胞動物成瘤有促進作用。PAP-腺苷的促增殖功能可能是通過刺激A2B腺苷受體,并激活Akt和Erk-1/2通路實現的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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5 劉U，

本文編號：2428980