【摘要】：研究背景在缺血缺氧性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如缺血性腦卒中、脊髓損傷中,缺氧是關(guān)鍵的病理性刺激因素,受損的神經(jīng)組織和細(xì)胞因缺乏氧供,能量合成不足,代謝功能受限,導(dǎo)致細(xì)胞損傷乃至細(xì)胞死亡,從而導(dǎo)致機(jī)體的功能障礙。壞死和凋亡是神經(jīng)系統(tǒng)缺氧損傷的兩個(gè)主要病理途徑,在缺血中心區(qū),血流量極度減少,細(xì)胞壞死；在缺血周邊區(qū),側(cè)支血流可以緩沖損傷的程度,細(xì)胞多表現(xiàn)為凋亡形式。受缺血區(qū)域周圍細(xì)胞的凋亡包括Caspase依賴途徑和Caspase非依賴途徑,Caspase-3是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)物之一,能使維持生命的蛋白形成眾多裂口,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞壞死不可逆轉(zhuǎn),但細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞基因調(diào)控的、具有程序化發(fā)生特點(diǎn)的細(xì)胞漸進(jìn)性死亡過(guò)程。眾多因子參與到細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)與發(fā)展過(guò)程,通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子及其相關(guān)通路的調(diào)控,可以抑制細(xì)胞凋亡,減輕細(xì)胞損傷程度。為減輕損傷,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生,一些與缺氧相關(guān)的代謝酶和轉(zhuǎn)錄因子會(huì)參與機(jī)體的缺氧調(diào)節(jié)。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1和基因同源(RHO)家族就參與眾多缺氧性疾病的調(diào)節(jié)過(guò)程。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1是細(xì)胞缺氧狀態(tài)下參與應(yīng)激反應(yīng)的重要因子,只有在缺氧狀態(tài)下,HIF-1才發(fā)揮其缺氧適應(yīng)作用。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β組成。HIF-1α含有氧依賴降解結(jié)構(gòu)域,是低氧功能單位,而HIF-1β只參與結(jié)構(gòu)性構(gòu)成。已有研究發(fā)現(xiàn),在缺氧性疾病,如嚴(yán)重?zé)齻�、慢性阻塞性肺病、癌癥等疾病的病理生理變化中,HIF-1能激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,并和其他信號(hào)通路互相影響,在缺氧后促進(jìn)血管生成、重建細(xì)胞代謝等途徑發(fā)揮作用。亦有研究證實(shí),在缺血缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷后,HIF-1可調(diào)控細(xì)胞凋亡,抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。RhoA屬于Rho小GTP酶家族,是RHO家族之一。缺氧激活之后,RhoA觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián),可直接產(chǎn)生各種細(xì)胞反應(yīng)。已證實(shí)RhoA途徑可起到促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生、減輕血管痙攣、促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組生長(zhǎng)、減少活性氧自由基的產(chǎn)生、減輕細(xì)胞凋亡等作用。Rho激酶(ROCK)是RhoA的下游靶效應(yīng)分子,其包括ROCK1和ROCK2兩種成分。有研究證明在神經(jīng)軸突再生過(guò)程中,RhoA/Rho激酶通路參與HIF-1α的表達(dá)與代謝過(guò)程。本課題旨在探討神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷早期,HIF-1α及RhoA在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中所起作用,并研究HIF-1α信號(hào)通路是否與RhoA通路存在相關(guān)及其具體作用方式。PC12細(xì)胞為可移植的鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞,體外培養(yǎng)可具備神經(jīng)元細(xì)胞特性。故實(shí)驗(yàn)選取PC12細(xì)胞體外培養(yǎng)并建立缺氧模型,在不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞凋亡及HIF-1α/RhoA對(duì)細(xì)胞凋亡的作用及兩者之間表達(dá)的相關(guān)性。目的1.觀察缺氧48小時(shí)內(nèi)PC12細(xì)胞凋亡狀況；2.研究PC12細(xì)胞缺氧早期HIF-1α的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；3.研究缺氧早期PC12細(xì)胞中RhoA的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。4.研究缺氧早期PC12細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)是否與RhoA通路相關(guān)。研究方法1.制作PC12細(xì)胞缺氧模型購(gòu)買PC12嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株置于低氧培養(yǎng)箱中,在37℃條件下培養(yǎng)0,2,4,6,12,24和48小時(shí)。使細(xì)胞持續(xù)處于低氧狀態(tài)培養(yǎng),并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。2.分別于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)缺氧后PC12細(xì)胞凋亡狀況2.1 PC12細(xì)胞凋亡檢測(cè)：使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒,并使用FACScan流式細(xì)胞儀來(lái)分析細(xì)胞凋亡的水平。結(jié)果表示為凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。2.2 caspase3活性測(cè)定使用caspase3活性測(cè)定試劑盒測(cè)定caspase3活性,用7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的相對(duì)熒光強(qiáng)度來(lái)表達(dá)活性,并與對(duì)照組相比。2.3 procaspase-3 (caspase-3前體)測(cè)定：Western blot分析測(cè)定PC12細(xì)胞缺氧處理后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)procaspase-3相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白的含。2.4活化的caspase測(cè)定：Western blot分析測(cè)定。2.5 PARP(聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶)裂解物測(cè)定：Western blot分析測(cè)定。2.6釋放細(xì)胞色素C (Cyto C)測(cè)定：Western blot分析測(cè)定。3.過(guò)表達(dá)HIF-1α基因的質(zhì)粒,檢測(cè)HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的作用。3.1建立HIF-1α過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染組模型和對(duì)照組模型：pcDNA3.1 (+)為載體過(guò)表達(dá)HIF-1α基因,同時(shí)建立對(duì)照組,兩組轉(zhuǎn)染成功后,同第1條所述方法,建立低氧模型。3.2測(cè)定HIF-1α轉(zhuǎn)染狀況：RT-PCR的和Western blot分析轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組在缺氧12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)HIF-1α和HIF-1β的mRNA和蛋白水平。3.3 測(cè)定HIF-1α轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡數(shù),測(cè)定HIF-1α轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組caspase-3活性。4. 檢測(cè)PC12細(xì)胞缺氧處理后RhoA及其相關(guān)蛋白(RhoB, Rock 1和Rock 2)的表達(dá)。Western blot分析測(cè)定PC12細(xì)胞缺氧處理后2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí),RhoA、RhoB、Rock 1、Rock2含量。5. 小干擾RNA (si RNA)印制RhoA表達(dá),檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)下PC12細(xì)胞中HIF-1α表達(dá),觀察其與是否存在RhoA依賴關(guān)系及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。5.1建立isRNA RhoA組模型和對(duì)照組模型：購(gòu)買isRNA RhoA試劑,轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,同時(shí)建立對(duì)照組,RT-PCR和Western blot分析RhoA的mRNA和蛋白水平。兩組轉(zhuǎn)染成功后,同第1條所述方法,建立低氧模型。5.2 HIF-1α測(cè)定：RT-PCR和Western blot分析測(cè)定isRNA RhoA組和對(duì)照組在缺氧12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)HIF-1α的mRNA和蛋白水平。5.3細(xì)胞凋亡的測(cè)定：細(xì)胞凋亡數(shù)、caspase-3活性測(cè)定,兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)均用Means ± SEM表示,使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用ANOVA,組間兩兩比較采用Dunnet檢驗(yàn),P0.05時(shí)即認(rèn)為差別有顯著性。結(jié)果1.PCI2細(xì)胞缺氧處理后48h,細(xì)胞凋亡數(shù)目增力口,caspase-3活性增強(qiáng),其前體含量減少,活化產(chǎn)物含量增加,PARP裂解物增多,釋放的Cyto C增多。2. HIF-1α過(guò)表達(dá)后,PCI2細(xì)胞缺氧處理12h、24h、48h, HIF-1α的表達(dá)增加,HIF-1β表達(dá)未見(jiàn)明顯變化,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡數(shù)目減少,caspase-3活性降低。3.PCI2細(xì)胞缺氧處理后2h、4h、6h, RhoA, Rock1、Rock2的含量增加,RhoB的含量未見(jiàn)明顯改變。4.抑制RhoA表達(dá)后,PCI2細(xì)胞缺氧處理12h、24h、48h, HIF-1α表達(dá)減少,細(xì)胞凋亡數(shù)目增加,caspase-3活性增強(qiáng)。結(jié)論1.PCI2細(xì)胞缺氧48h,細(xì)胞凋亡隨時(shí)間的增加而增加。2.PCI2細(xì)胞缺氧后24-48h, HIF-1α并具有保護(hù)細(xì)胞、減輕凋亡的作用。3.PCI2細(xì)胞缺氧后2-6h, RhoA通路具有抑制凋亡的作用。4.PCI2細(xì)胞缺氧后2-6h, RhoB的信號(hào)通路未參與缺氧后細(xì)胞調(diào)控。5.PCI2細(xì)胞缺氧后48h, HIF-1α的表達(dá)呈RhoA的依賴性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：2428036