【摘要】：目的1.通過檢測HCMV即刻早期基因IE2在臨床新鮮膠質(zhì)瘤及急性腦外傷組織中的表達(dá)情況,明確HCMV感染與膠質(zhì)瘤分級及發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性;2.分析膠質(zhì)瘤及急性腦外傷組織中ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化情況及基因表達(dá)情況,探討HCMV感染對ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化水平及基因表達(dá)水平的影響;3.建立HCMV感染astrocytes、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞模型,在細(xì)胞水平探討HCMV感染對ATF5啟動子區(qū)Cp G島的甲基化水平及基因表達(dá)水平的影響;4.研究S-腺苷甲硫氨酸對HCMV感染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化水平及基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,以及對甲基化相關(guān)基因(TET1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)的表達(dá)水平的影響,探討HCMV參與膠質(zhì)瘤發(fā)展的可能機(jī)制,并為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路及靶點。方法1.收集新鮮的臨床膠質(zhì)瘤組織,并對臨床病理資料進(jìn)行匯總分析;2.采用RT-PCR法檢測膠質(zhì)瘤組織及對照組織中IE2 m RNA的表達(dá)水平,分析HCMV感染與膠質(zhì)瘤分級及發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性;3.使用在線軟件分析ATF5基因啟動子區(qū)Cp G的分布情況,預(yù)測Cp G島,設(shè)計合成甲基化引物,然后提取組織DNA,重亞硫酸鹽處理,PCR擴(kuò)增,切膠回收,單克隆測序,分析各級別膠質(zhì)瘤組織及對照組織中ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化情況及其與HCMV感染及膠質(zhì)瘤病理分級的相關(guān)性;4.Quantitative RT-PCR檢測上述樣本中ATF5基因的表達(dá)情況,分析病毒感染對甲基化水平及基因表達(dá)水平的影響;5.進(jìn)一步結(jié)合臨床資料分析ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化狀態(tài)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系;6.分離培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞,制備HCMV毒種,建立HCMV感染astrocytes、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞模型,并用S-腺苷甲硫氨酸處理細(xì)胞;7.采用BSP測序技術(shù)分析ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化的變化,分析HCMV感染及S-腺苷甲硫氨酸對膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化水平的影響;8.采用RT-PCR及Western Blot檢測HCMV感染及S-腺苷甲硫氨酸處理對ATF5及甲基化相關(guān)基因(TET1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)表達(dá)的影響;9.CCK-8法檢測HCMV及S-腺苷甲硫氨酸對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果1.共收集35例膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本以及5例急性腦外傷組織標(biāo)本作為對照。WHOⅠ-Ⅱ級為低級別,高分化,10例;WHOⅢ-Ⅳ級為高級別,低分化,25例。RT-PCR結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤標(biāo)本中IE2 m RNA的表達(dá)量明顯高于對照組織(P0.05),并且高級別膠質(zhì)瘤組織中IE2 m RNA的表達(dá)量也高于低級別膠質(zhì)瘤組織(P0.05),而對照組織中IE2呈現(xiàn)低表達(dá),這表明IE2的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤分級密切相關(guān);2.BSP測序結(jié)果顯示,5例正常腦組織,10例低級別膠質(zhì)瘤及25例高級別膠質(zhì)瘤中ATF5基因啟動子區(qū)Cp G島的甲基化比例分別為87.78%、73.89%、47.70%,甲基化比例逐漸降低,且兩兩相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3.Quantitative RT-PCR結(jié)果表明,與對照組相比,膠質(zhì)瘤標(biāo)本中ATF5表達(dá)水平升高(P0.05);且HCMV陽性膠質(zhì)瘤組織中ATF5表達(dá)水平高于HCMV陰性膠質(zhì)瘤組織及對照組;ATF5表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤分級及HCMV感染具有相關(guān)性,且膠質(zhì)瘤組織中ATF5基因啟動子區(qū)Cp G島的甲基化狀態(tài)對該基因的表達(dá)有重要意義;4.在與患者的臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn),ATF5啟動子區(qū)Cp G島的甲基化狀態(tài)與膠質(zhì)瘤分級密切相關(guān)(P0.05);而與腫瘤大小、患者年齡等分析中,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;5.HCMV感染后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),astrocytes、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞均出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng),為HCMV容許細(xì)胞;6.BSP測序結(jié)果表明,在astrocytes中,病毒感染前,ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化比例為96.30%,感染6h后,甲基化比例為46.30%,與對照組相比,甲基化比例明顯降低(P0.05);在U87及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,病毒感染72h后,ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化比例明顯降低(P0.05);SAM處理組以及HCMV+SAM共同處理組中ATF5啟動子區(qū)Cp G島甲基化水平升高;7.RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,HCMV感染能夠提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ATF5m RNA及蛋白表達(dá)水平,SAM處理后,ATF5基因及蛋白表達(dá)水平下降;并且HCMV感染astrocytes6h及膠質(zhì)瘤細(xì)胞72h后,TET1表達(dá)水平上升,DNMT1表達(dá)水平下降,而DNMT3A、DNMT3B沒有明顯變化。SAM處理組及HCMV+SAM共同處理組,TET1表達(dá)水平降低,DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化;8.CCK-8結(jié)果顯示,HCMV感染能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,而SAM可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,對astrocytes的增殖沒有明顯影響。結(jié)論1.HCMV即刻早期基因IE2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),與膠質(zhì)瘤分級呈正相關(guān);2.各級別膠質(zhì)瘤組織中ATF5的甲基化水平低于對照組,而表達(dá)水平高于對照組,表明該基因的甲基化狀態(tài)與膠質(zhì)瘤分級有相關(guān)性,且對該基因的表達(dá)有影響;3.HCMV可能通過上調(diào)TET1表達(dá)水平,降低DNMT1表達(dá)水平,降低ATF5啟動子區(qū)Cp G島的甲基化水平,促進(jìn)其基因及蛋白表達(dá)水平;4.SAM可能通過降低TET1表達(dá)水平,使得ATF5甲基化水平升高而抑制基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
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【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2426231