【摘要】：背景原發(fā)性腦出血具有極高的致殘率和致死率,在出血后復雜的病理進程中,繼發(fā)性腦水腫是腦出血后神經功能障礙的形成或導致病人致死的關鍵因素。研究證實腦出血后腦水腫的發(fā)生、發(fā)展與水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)的表達異常有關。AQP4是腦內最主要的水轉運蛋白,它主要分布部位是腦實質和腦內液體腔的邊界上,比如血管周圍星形膠質細胞的足突,膠質界膜,室管膜細胞,它使水沿著滲透壓和靜水壓梯度從高向低流動。在不同的病理模型實驗中,AQP4展現了對水的雙向轉運能力,它既可以在細胞毒性腦水腫中參與腦水腫的產生,也可以在血管源性腦水腫中參與腦水腫的清除。因此,針對腦水腫的治療,AQP4可以成為潛在的藥物治療靶點,在細胞毒性的腦水腫中通過抑制AQP4的功能有利于減輕水腫,而在血管源性的腦水腫中通過促進其功能有利于減輕水腫。在對AQP4調控的研究中發(fā)現,AQP4可以在一定條件下出現亞細胞定位的改變。包括AQP4在內的部分膜蛋白,可以通過內吞的方式發(fā)生內化(internalization),甚至還可以分選(sorting)至溶酶體而降解。AQP4內化可以使其亞細胞定位發(fā)生改變,從而影響它在水平衡、水轉運中的調節(jié)作用。目前,關于腦出血后AQP4的表達變化是否與其內化以及溶酶體降解有關尚未見報道。因此,本課題擬從在體和離體兩方面展開研究。通過膠原酶誘導大鼠腦出血模型,觀察在腦出血后腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中是否存在AQP4內化和溶酶體分選的現象,并通過凝血酶處理來制作腦出血的細胞模型,檢測AQP4錨定的關鍵分子a-syntrophin的表達,探討它和AQP4內化的關系,為臨床腦出血所致的腦水腫的治療提供實驗基礎。研究目的1.研究腦出血后腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中,是否存在AQP4內化和溶酶體分選現象,并探討其在腦水腫發(fā)生發(fā)展中的作用。2.凝血酶處理對原代星形膠質細胞AQP4內化的影響,并探討AQP4錨定的關鍵分子a-syntrophin和AQP4內化的關系。研究內容和方法1.健康成年雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠114只,隨機分為腦出血組(intracerebral hemorrhage, ICH)和假手術組造模。采用右側尾狀核緩慢注射細菌性膠原酶2μl(0.25 U/μl)制作ICH模型,并分別在術后6 h,12 h,24 h,48 h,72 h進行檢測。采用HE染色觀察腦出血后的血腫病理,并使用透射電鏡觀察腦出血后早期腦內的超微結構,以明確腦出血后早期腦水腫的類型；使用干濕重法檢測各組各時間點的腦組織含水量BWC (brain water content)的變化,用伊文氏藍EB (Evans blue)作為示蹤劑檢測腦出血后血腦屏障的完整性；使用q-PCR和Western blot技術檢測腦出血后AQP4的mRNA和蛋白表達變化；采用免疫熒光雙標技術檢測AQP4分別與晚期內涵體標記物(mannose-6-phosphate receptor, MPR)和溶酶體標記物(lysosomalassociated membrane protein-1, LAMP1)的共表達,使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測定AQP4與LAMP1共表達的比例；2.取新生SD大鼠(2 d內)的大腦皮質進行星形膠質細胞的原代培養(yǎng),隨機分為凝血酶處理組和對照組,對照組不做任何處理,凝血酶組用100 U/ml凝血酶處理細胞24 h后繼續(xù)培養(yǎng)。采用乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase, LDH)釋放法檢測凝血酶對細胞的毒性作用；用免疫熒光染色檢測細胞的AQP4表達；采用免疫熒光雙標技術檢測AQP4分別與MPR和LAMP1的共表達,AQP4與a-syntrophin的共表達；使用Western blot技術檢測兩組細胞AQP4和a-syntrophin蛋白的表達變化。結果1.大鼠腦出血后AQP4內化和溶酶體分選：①病理觀察：ICH后1d星形膠質細胞的足突腫脹明顯,內皮被覆的基膜不完整而且出現腫脹,血管周圍間隙增寬；②BWC在ICH后3h開始升高,到6h則明顯增高(P0.05),48 h到達峰值；EB在ICH后1h就可見到從血管滲出,ICH后6h明顯增高(P0.01),達到峰值。③QP4 mRNA在ICH后24 h,48 h和72 h都出現了明顯的增高(P0.01),其上調峰值出現在ICH后24 h；AQP4蛋白在ICH后12h開始明顯上調(P0.05),至24 h升至其峰值(P0.01)。④ICH后各時間點(6h,12 h,24h,48h),在脈絡叢,血腫周圍,大腦皮質都可以看到AQP4和MPR以及AQP4和LAMP1的共定位表達。AQP4和LAMP1共表達比例的計算顯示共表達量隨著ICH后的時間呈現依賴關系,與對照組相比,共表達比例具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.凝血酶處理對AQP4星形膠質細胞表達的影響①凝血酶處理導致星形膠質細胞的死亡率為30.17%±2.79%；②對照組,AQP4呈簇狀或線狀分布于星形膠質細胞膜；凝血酶組AQP4既呈點簇狀分布于細胞膜,更多的則是細小顆粒狀分布于細胞漿內,AQP4蛋白的表達在凝血酶處理之后并沒有明顯變化。③凝血酶處理星形膠質細胞以后,AQP4與MPR及LAMP1均出現了共表達的情況；④凝血酶處理使得a-syntrophin在星形膠質細胞上的表達明顯減弱,蛋白表達明顯降低,統(tǒng)計學分析有顯著差異(P0.01)。結論1.大鼠腦出血后腦水腫發(fā)生發(fā)展過程中,伴隨著AQP4 mRNA和蛋白的水平上調,可以觀察到AQP4內化到了晚期內涵體,部分內化的AQP4可以分選至溶酶體被降解。2.凝血酶處理可以導致星形膠質細胞膜上的AQP4內化并進一步分選至溶酶體而降解。凝血酶處理后AQP4和a-syntrophin的共表達及其微弱,同時a-syntrophin蛋白表達明顯降低,其表達的減少直接影響了AQP4在細胞膜上的錨定,造成了AQP4表達部位的變化。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.34

【參考文獻】

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1 邱國平;孫善全;劉輝;卓飛;楊美;;腦出血后水通道蛋白4與內向整流性鉀通道4.1的再分布與腦水腫形成的關系[J];解剖學雜志;2009年06期

2 李燕華,孫善全;低滲液對星形膠質細胞水通道蛋白-4表達的影響[J];中華醫(yī)學雜志;2004年06期

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本文編號：2400395