【摘要】：背景原發(fā)性腦出血具有極高的致殘率和致死率,在出血后復雜的病理進程中,繼發(fā)性腦水腫是腦出血后神經(jīng)功能障礙的形成或?qū)е虏∪酥滤赖年P(guān)鍵因素。研究證實腦出血后腦水腫的發(fā)生、發(fā)展與水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)的表達異常有關(guān)。AQP4是腦內(nèi)最主要的水轉(zhuǎn)運蛋白,它主要分布部位是腦實質(zhì)和腦內(nèi)液體腔的邊界上,比如血管周圍星形膠質(zhì)細胞的足突,膠質(zhì)界膜,室管膜細胞,它使水沿著滲透壓和靜水壓梯度從高向低流動。在不同的病理模型實驗中,AQP4展現(xiàn)了對水的雙向轉(zhuǎn)運能力,它既可以在細胞毒性腦水腫中參與腦水腫的產(chǎn)生,也可以在血管源性腦水腫中參與腦水腫的清除。因此,針對腦水腫的治療,AQP4可以成為潛在的藥物治療靶點,在細胞毒性的腦水腫中通過抑制AQP4的功能有利于減輕水腫,而在血管源性的腦水腫中通過促進其功能有利于減輕水腫。在對AQP4調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn),AQP4可以在一定條件下出現(xiàn)亞細胞定位的改變。包括AQP4在內(nèi)的部分膜蛋白,可以通過內(nèi)吞的方式發(fā)生內(nèi)化(internalization),甚至還可以分選(sorting)至溶酶體而降解。AQP4內(nèi)化可以使其亞細胞定位發(fā)生改變,從而影響它在水平衡、水轉(zhuǎn)運中的調(diào)節(jié)作用。目前,關(guān)于腦出血后AQP4的表達變化是否與其內(nèi)化以及溶酶體降解有關(guān)尚未見報道。因此,本課題擬從在體和離體兩方面展開研究。通過膠原酶誘導大鼠腦出血模型,觀察在腦出血后腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選的現(xiàn)象,并通過凝血酶處理來制作腦出血的細胞模型,檢測AQP4錨定的關(guān)鍵分子a-syntrophin的表達,探討它和AQP4內(nèi)化的關(guān)系,為臨床腦出血所致的腦水腫的治療提供實驗基礎(chǔ)。研究目的1.研究腦出血后腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中,是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選現(xiàn)象,并探討其在腦水腫發(fā)生發(fā)展中的作用。2.凝血酶處理對原代星形膠質(zhì)細胞AQP4內(nèi)化的影響,并探討AQP4錨定的關(guān)鍵分子a-syntrophin和AQP4內(nèi)化的關(guān)系。研究內(nèi)容和方法1.健康成年雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠114只,隨機分為腦出血組(intracerebral hemorrhage, ICH)和假手術(shù)組造模。采用右側(cè)尾狀核緩慢注射細菌性膠原酶2μl(0.25 U/μl)制作ICH模型,并分別在術(shù)后6 h,12 h,24 h,48 h,72 h進行檢測。采用HE染色觀察腦出血后的血腫病理,并使用透射電鏡觀察腦出血后早期腦內(nèi)的超微結(jié)構(gòu),以明確腦出血后早期腦水腫的類型；使用干濕重法檢測各組各時間點的腦組織含水量BWC (brain water content)的變化,用伊文氏藍EB (Evans blue)作為示蹤劑檢測腦出血后血腦屏障的完整性；使用q-PCR和Western blot技術(shù)檢測腦出血后AQP4的mRNA和蛋白表達變化；采用免疫熒光雙標技術(shù)檢測AQP4分別與晚期內(nèi)涵體標記物(mannose-6-phosphate receptor, MPR)和溶酶體標記物(lysosomalassociated membrane protein-1, LAMP1)的共表達,使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測定AQP4與LAMP1共表達的比例；2.取新生SD大鼠(2 d內(nèi))的大腦皮質(zhì)進行星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng),隨機分為凝血酶處理組和對照組,對照組不做任何處理,凝血酶組用100 U/ml凝血酶處理細胞24 h后繼續(xù)培養(yǎng)。采用乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase, LDH)釋放法檢測凝血酶對細胞的毒性作用；用免疫熒光染色檢測細胞的AQP4表達；采用免疫熒光雙標技術(shù)檢測AQP4分別與MPR和LAMP1的共表達,AQP4與a-syntrophin的共表達；使用Western blot技術(shù)檢測兩組細胞AQP4和a-syntrophin蛋白的表達變化。結(jié)果1.大鼠腦出血后AQP4內(nèi)化和溶酶體分選：①病理觀察：ICH后1d星形膠質(zhì)細胞的足突腫脹明顯,內(nèi)皮被覆的基膜不完整而且出現(xiàn)腫脹,血管周圍間隙增寬；②BWC在ICH后3h開始升高,到6h則明顯增高(P0.05),48 h到達峰值；EB在ICH后1h就可見到從血管滲出,ICH后6h明顯增高(P0.01),達到峰值。③QP4 mRNA在ICH后24 h,48 h和72 h都出現(xiàn)了明顯的增高(P0.01),其上調(diào)峰值出現(xiàn)在ICH后24 h；AQP4蛋白在ICH后12h開始明顯上調(diào)(P0.05),至24 h升至其峰值(P0.01)。④ICH后各時間點(6h,12 h,24h,48h),在脈絡(luò)叢,血腫周圍,大腦皮質(zhì)都可以看到AQP4和MPR以及AQP4和LAMP1的共定位表達。AQP4和LAMP1共表達比例的計算顯示共表達量隨著ICH后的時間呈現(xiàn)依賴關(guān)系,與對照組相比,共表達比例具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.凝血酶處理對AQP4星形膠質(zhì)細胞表達的影響①凝血酶處理導致星形膠質(zhì)細胞的死亡率為30.17%±2.79%；②對照組,AQP4呈簇狀或線狀分布于星形膠質(zhì)細胞膜；凝血酶組AQP4既呈點簇狀分布于細胞膜,更多的則是細小顆粒狀分布于細胞漿內(nèi),AQP4蛋白的表達在凝血酶處理之后并沒有明顯變化。③凝血酶處理星形膠質(zhì)細胞以后,AQP4與MPR及LAMP1均出現(xiàn)了共表達的情況；④凝血酶處理使得a-syntrophin在星形膠質(zhì)細胞上的表達明顯減弱,蛋白表達明顯降低,統(tǒng)計學分析有顯著差異(P0.01)。結(jié)論1.大鼠腦出血后腦水腫發(fā)生發(fā)展過程中,伴隨著AQP4 mRNA和蛋白的水平上調(diào),可以觀察到AQP4內(nèi)化到了晚期內(nèi)涵體,部分內(nèi)化的AQP4可以分選至溶酶體被降解。2.凝血酶處理可以導致星形膠質(zhì)細胞膜上的AQP4內(nèi)化并進一步分選至溶酶體而降解。凝血酶處理后AQP4和a-syntrophin的共表達及其微弱,同時a-syntrophin蛋白表達明顯降低,其表達的減少直接影響了AQP4在細胞膜上的錨定,造成了AQP4表達部位的變化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.34

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 邱國平;孫善全;劉輝;卓飛;楊美;;腦出血后水通道蛋白4與內(nèi)向整流性鉀通道4.1的再分布與腦水腫形成的關(guān)系[J];解剖學雜志;2009年06期

2 李燕華,孫善全;低滲液對星形膠質(zhì)細胞水通道蛋白-4表達的影響[J];中華醫(yī)學雜志;2004年06期

，

本文編號：2400395