【摘要】：膠質母細胞瘤(glioblastoma,GBM)是中樞神經系統中最常見的原發(fā)性腫瘤[1],具有細胞高度增殖、血管形成異常、向周圍侵襲遷移等生物學特點[2,3]。隨著新的影像學輔助技術的不斷發(fā)展和微創(chuàng)手術理念的不斷完善[4,5],腫瘤的影像學切除率得到極大程度的提高,患者的中位生存期獲得延長,生存質量得以改善,然而由于膠質母細胞侵襲浸潤性生長的生物學特性,導致腫瘤極易發(fā)生侵襲遷移,引起腫瘤的復發(fā)播散,嚴重制約了治療效果的提高,也導致了患者不良的預后[6]。腫瘤微環(huán)境是一個復雜的動態(tài)局部環(huán)境,包括腫瘤細胞、腫瘤基質細胞(免疫細胞、成纖維細胞等)、細胞外基質以及微環(huán)境內細胞通過旁分泌或自分泌產生的多種細胞外因子,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖以及侵襲遷移中發(fā)揮著重要作用[7,8]。由于腫瘤組織內細胞增殖迅速、血管形成異常、能量代謝異常的特點,導致了腫瘤細胞營養(yǎng)缺乏以及腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞外酸內堿的狀態(tài)[9,10],腫瘤細胞可能為了破解這種生存環(huán)境的壓力而向遠處轉移,侵襲到營養(yǎng)相對豐富更適宜的區(qū)域,造成腫瘤的播散。鈉氫交換體1(sodium hydrogen exchanger 1,NHE1)是鈉氫交換體家族中的一員,是廣泛分布于各類細胞細胞膜的一離子通道種,生理狀態(tài)下,NHE1的主要功能在于維持細胞內外酸堿平衡以及細胞體積的調節(jié)[11]。研究表明,NHE1是腫瘤細胞微環(huán)境酸化的主要調節(jié)因子[12],在多種腫瘤如肝癌[13,14]、宮頸癌[15,16]、乳腺癌[17,18]等中表達上調或激活,增加了腫瘤細胞侵襲遷移的能力。而在膠質瘤研究中其發(fā)揮怎樣的作用尚不明確。本課題研究膠質瘤組織NHE1的表達及其與預后的關系,并通過體外實驗在高表達NHE1的人惡性膠質瘤細胞系中探究其在膠質瘤細胞侵襲遷移運動的作用及其可能機制。課題研究分為以下兩個部分:1、NHE1在不同級別膠質瘤組織中的表達情況及其與臨床預后的關系。首先應用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫中GBM及較低級別膠質瘤(lower grade glioma,LGG)患者的樣本數據及其對應的臨床數據,分析NHE1在GBM及LGG患者中的差異性表達,并依據NHE1表達情況的差異,分析GBM患者的臨床預后;然后應用免疫組織化學染色的方法對我院手術采集的40例不同病理級別的膠質瘤組織樣本及10例正常對照腦組織樣本進行檢測,分析樣本中NHE1表達情況的差異;同時對不同病理級別的膠質瘤組織樣本及對照腦組織中NHE1 mRNA水平和蛋白的表達量應用Real-time PCR和western blot的方法進行定量分析。然后采用western blot的方法篩選出表達NHE1蛋白較高的惡性膠質瘤細胞系進行后續(xù)體外實驗。結果顯示,TCGA數據庫中172例GBM患者樣本中NHE1的表達水平明顯高于350例LGG患者樣本中NEH1的表達水平,NHE1的表達水平與GBM患者的預后存在顯著相關性,表達水平越高,患者預后越差,生存期越短。本院采集的手術組織樣本中,NHE1在對照腦組織樣本中不表達或弱陽性表達,在高級別膠質瘤組織樣本中表達增高,并且陽性率隨著腫瘤病理級別的增高而增高。Real-time PCR和western blot的檢測結果顯示與TCGA數據庫分析結果及免疫組化染色結果相符合。在U87和SNB19兩個膠質瘤細胞系中western blot檢測顯示NHE1蛋白表達量較高,用于后續(xù)體外實驗研究。2、研究NHE1在膠質瘤細胞遷移和侵襲中的作用。應用含有0.2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,在U87和SNB19兩種細胞系中,應用干擾NHE1表達的siRNA對細胞進行轉染,分別分為siRNA-NHE1組、siRNA-NC組(轉入無義序列)和control組,在不同的處理組中,NHE1 mRNA及蛋白表達水平分別采用Real-time PCR和western blot檢測,細胞免疫熒光技術檢測NHE1的表達情況與細胞偽足形成情況,Transwell實驗和劃痕實驗分別檢測膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力,熒光基質膠降解實驗觀察NHE1對于膠質瘤細胞侵襲性偽足形成和熒光基質膠降解的影響,western blot技術檢測膠質瘤細胞MMP-9、MMP-2、cortactin、p-cortactin的蛋白表達量。結果顯示:應用siRNA敲低NHE1的表達,抑制了膠質瘤細胞的侵襲遷移的能力;NHE1蛋白在細胞的侵襲性偽足前端富集;敲低NHE1的表達后其侵襲性偽足形成和基質膠降解能力顯著下降(P0.05);相較于control組和siRNA-NC組,si RNA-NHE1組膠質瘤細胞MMP-9、MMP-2、p-cortactin表達明顯降低(P0.05),cortactin無明顯變化(P0.05)。結論:1、膠質瘤組織樣本中NHE1表達增高,高級別膠質瘤組織樣本中表達明顯高于正常對照腦組織樣本與低級別膠質瘤組織樣本,并且在GBM患者中NHE1的表達水平與患者預后相關,表達越高,預后越差。2、抑制NHE1蛋白的表達,可抑制膠質瘤細胞MMP-2和MMP-9的表達以及侵襲性偽足的形成,進而影響膠質瘤細胞侵襲和遷移的能力。3、NHE1富集于侵襲性偽足前端,可能通過改變侵襲偽足局部pH值影響cortactin的磷酸化,從而影響侵襲性偽足的形成。4、針對NHE1的靶向藥物有望抑制膠質瘤細胞的侵襲遷移。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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1 陳磊;朱蒙;于圣平;張辰;趙鵬飛;周華;海龍;劉波;李帥;周星辰;林雨;楊學軍;;ABL2基因表達沉默對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響[J];中華神經醫(yī)學雜志;2015年03期

2 朱蒙;楊學軍;;鈣信號在惡性腫瘤侵襲遷移中的作用[J];國際腫瘤學雜志;2014年03期

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本文編號：2372778