【摘要】：膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma,GBM)是惡性程度高的膠質(zhì)瘤,擁有很強的增殖、遷移和侵襲能力。約占全部顱內(nèi)腫瘤的12~15%,由于腫瘤與正常的腦組織之間沒有特別明顯的邊界,手術(shù)方法也不能將其完全切除,又因其發(fā)生于顱腔中,常規(guī)的放療和化療對殘留的腫瘤細胞殺傷能力有限,所以膠質(zhì)母細胞瘤病人的生存狀況一直得不到很好的改善,患者的平均壽命僅為15個月左右,只有5%的患者壽命能夠延續(xù)5年以上,多數(shù)患者仍然死于膠質(zhì)母細胞瘤的復發(fā)。因此深入了解膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病及惡化的分子機制,推動其預防和治療手段的發(fā)展迫在眉睫。轉(zhuǎn)錄因子HOXC9(Homeobox C9)是同源異形框(Homeobox,HOX)家族的成員之一,主要在胚胎發(fā)育及成體細胞分化過程中提供前后軸定位信息的作用。近年來有報道顯示HOXC9基因的表達異�？赡芘c一些腫瘤的形成有關(guān),因此闡明其與腫瘤之間的關(guān)系可能為腫瘤的治療提供新的思路。而HOXC9基因與膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展是否相關(guān)目前還沒有相關(guān)的報道。本項目就此展開研究探討HOXC9對膠質(zhì)母細胞瘤病人預后的影響,及其對膠質(zhì)母細胞瘤增殖、成瘤、遷移、侵襲能力的影響,并對HOXC9調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞自噬的機制進行了深入的研究,為膠質(zhì)母細胞瘤的治療提供新的生物學理論和分子基礎(chǔ)。本研究目前取得的研究成果如下:(1)HOXC9對膠質(zhì)母細胞瘤預后的影響及其表達分析為了研究HOXC9在膠質(zhì)母細胞瘤中擔任什么角色,它的表達量是否與膠質(zhì)母細胞瘤病人的預后相關(guān),我們首先通過利用R2:Genomics Analysis and Visualization Platform平臺上的兩個數(shù)據(jù)庫對膠質(zhì)瘤病人預后和HOXC9表達量之間的關(guān)系進行分析。結(jié)果表明,HOXC9的表達量與膠質(zhì)瘤病人的預后密切相關(guān)。HOXC9表達量高,病人預后差,生存率低;HOXC9表達量低,病人預后好,生存率高。由此可見,HOXC9的表達量與膠質(zhì)瘤病人的預后密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤的預后與其臨床分級有關(guān),分級越高,患者的預后越差。我們通過數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)對不同分級膠質(zhì)瘤中HOXC9的表達量進行分析,我們發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤中HOXC9的表達量要高于正常膠質(zhì)細胞,這暗示著HOXC9可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程。此外,并且隨著膠質(zhì)瘤分級的提高,HOXC9的表達量也隨之提高,二者存在正相關(guān),這暗示著HOXC9可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展過程。我們還發(fā)現(xiàn),在不同分級膠質(zhì)瘤中HOXC9的表達量也與病人的預后密切相關(guān)。HOXC9表達量高,病人預后差,生存率低;HOXC9表達量低,病人預后好,生存率高。隨后,我們用免疫印跡四個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中HOXC9蛋白的表達量做了檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),HOXC9在四個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中普遍表達。A172的惡性程度在四個細胞系中相對較低,沒有成瘤能力,而它的HOXC9蛋白的表達量在四個細胞系中也相對較低,這暗示著HOXC9的表達量與膠質(zhì)母細胞瘤的惡性程度可能存在一定的相關(guān)性。此外,我們通過免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)和免疫印跡(Western Blot)檢測膠質(zhì)母細胞瘤臨床樣本及其癌旁組織中HOXC9的表達量。從結(jié)果我們可以看到,膠質(zhì)母細胞瘤樣本中HOXC9的表達水平要明顯高于其癌旁組織,這說明HOXC9可能參與膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生過程。(2)HOXC9對膠質(zhì)母細胞瘤增殖、遷移侵襲能力的影響為了研究下調(diào)HOXC9對膠質(zhì)母細胞瘤增殖能力的影響,我們利用慢病毒介導的RNAi技術(shù)在三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系里干擾HOXC9基因的表達。在下調(diào)HOXC9表達之后,我們從顯微鏡觀察到三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系實驗組的細胞數(shù)目要明顯少于對照組,我們通過血球計數(shù)板分別對兩組細胞的數(shù)量進行計數(shù),統(tǒng)計結(jié)果也與上述類似。這暗示著下調(diào)HOXC9會影響膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖能力。此外,我們用MTT法和Brd U法比較對照組與實驗組的細胞增殖能力。MTT法檢測顯示三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的細胞的增殖能力都在下調(diào)HOXC9之后發(fā)生了明顯的下降。免疫熒光檢測及陽性信號統(tǒng)計顯示實驗組Brd U陽性細胞數(shù)目要明少于對照組,這說明實驗組在進行DNA復制的細胞減少,這也從另一個角度說明實驗組細胞增殖能力減弱。為了研究下調(diào)HOXC9對膠質(zhì)母細胞瘤細胞遷移及侵襲能力有沒有影響,我們首先進行了細胞劃痕實驗。從兩個細胞系的實驗結(jié)果我們可以看出,HOXC9干擾組膠質(zhì)母細胞瘤細胞的劃痕愈合能力要明顯弱于對照組,這說明HOXC9干擾組細胞的遷移能力被削弱。隨后,我們又進行了Transwell實驗。實驗結(jié)果表明,兩個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系HOXC9下調(diào)組在相同時間內(nèi)穿膜的細胞數(shù)要明顯少于對照組。這再次說明HOXC9在膠質(zhì)母細胞瘤細胞遷移能力中發(fā)揮重要作用。為了檢測細胞的侵襲能力是否受到影響,我們進行了基質(zhì)膠(Matrigel)Transwell實驗。實驗結(jié)果顯示,兩個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系下調(diào)HOXC9組穿過含有基質(zhì)膠的Transwell小室的能力要明顯比對照組弱。這說明膠質(zhì)母細胞瘤細胞的侵襲能力在下調(diào)HOXC9之后受到了抑制。(3)HOXC9對膠質(zhì)母細胞瘤自噬的影響及其調(diào)控機制通過流式細胞儀和Western Blot方法檢測我們發(fā)現(xiàn),三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系在干擾HOXC9之后并沒有發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。通過瞬時轉(zhuǎn)染,我們向細胞導入一個可以表達帶綠色熒光標簽GFP的LC3B蛋白的載體。從對三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的實驗中我們都觀察到,sh HOXC9組細胞在發(fā)生自噬;而Control組細胞沒有發(fā)生自噬。通過細胞免疫熒光實驗和Western Blot檢測我們發(fā)現(xiàn),下調(diào)HOXC9之后膠質(zhì)母細胞瘤細胞的自噬增強了。為了研究為何在膠質(zhì)母細胞瘤中下調(diào)HOXC9會引發(fā)細胞自噬,我們通過查閱相關(guān)文獻,篩選出8個候選可能參與調(diào)控自噬的基因。通過實時熒光定量PCR檢測我們發(fā)現(xiàn),在下調(diào)HOXC9之后,DAPK1基因的m RNA表達量顯著升高。我們把DAPK1作為潛在的重要下游靶標又進一步在三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系里面檢測他的蛋白表達,結(jié)果顯示,三個細胞系sh HOXC9組DAPK1蛋白的表達水平明顯高于Control組。DAPK1只有在其第308位絲氨酸沒有被磷酸化時才能夠激活細胞自噬,因此,我們通過Western Blot對兩個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的p Ser308-DAPK1進行了檢測,檢測結(jié)果顯示,在下調(diào)HOXC9之后p Ser308-DAPK1的量并沒有增多,而DAPK1的總量發(fā)生了明顯的上升,這說明308位絲氨酸沒有被磷酸化的DAPK1蛋白量相對升高,也就是說能夠激活細胞自噬的DAPK1蛋白發(fā)生上調(diào),從而增強細胞自噬。我們把皮下成瘤的樣本拿來檢測得到了類似的結(jié)果。接著,我們構(gòu)建了DAPK1 sh RNA慢病毒載體,在三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中下調(diào)HOXC9誘導細胞自噬后下調(diào)DAPK1基因的表達。通過Western Blot檢測我們發(fā)現(xiàn),三個細胞系下調(diào)DAPK1組細胞自噬明顯減弱。DAPK1誘導細胞自噬需要通過下游因子Beclin1介導,于是為了了解干擾HOXC9誘導的細胞自噬是否是通過DAPK1-Beclin1通路,我們構(gòu)建了Beclin1 sh RNA慢病毒載體。在兩種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中干擾HOXC9誘導細胞自噬后,下調(diào)Beclin1的表達,從實驗結(jié)果我們觀察到,下調(diào)Beclin1組比起對照組的自噬要明顯減弱。于是我們的實驗結(jié)果證明干擾HOXC9誘導的細胞自噬主要是通過激活DAPK1-Beclin1這條通路。為了了解HOXC9是如何調(diào)控DAPK1基因的表達,我們首先對DAPK1的啟動子進行了分析。我們克隆了5個長度不同DAPK1啟動子片段并將其插入p GL3-Basic熒光素酶報告載體上,通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)的檢測我們發(fā)現(xiàn),-1121~-368這段序列可能擁有能被某些轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合的微點存在。HOXC9通常作為一個轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控基因表達,為了了解HOXC9是否是DAPK1的轉(zhuǎn)錄抑制子,我們進行了染色體免疫共沉淀實驗。通過Ch IP實驗我們檢測到HOXC9在DAPK1啟動子-528~-412bp處有較高結(jié)合。有意思的是P2區(qū)域剛好落在-1121~-368之間,這暗示著HOXC9是通過結(jié)合到DAPK1啟動子-528~-412bp處抑制DAPK1基因的表達。過去曾有報道HOXC9可以特異的識別并結(jié)合ATTTAT序列,通過對DAPK1轉(zhuǎn)錄起始位點上游-528~-412bp序列進行分析,我們發(fā)現(xiàn)了一段ATTTAT序列位于-442~-437之間。以上數(shù)據(jù)表明,HOXC9是通過結(jié)合到DAPK1轉(zhuǎn)錄起始位點上游-442~-437序列來抑制DAPK1基因的表達。(4)HOXC9對膠質(zhì)母細胞瘤細胞成瘤能力的影響為了了解下調(diào)HOXC9是否對膠質(zhì)母細胞瘤的克隆形成能力有影響,我們用兩種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系進行了體外的軟瓊脂克隆形成實驗。從實驗結(jié)果我們觀察到,兩個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系sh HOXC9組形成的克隆大小比Control組要小,而且形成克隆的數(shù)目也比對照組要少。這說明干擾HOXC9的表達影響膠質(zhì)母細胞瘤的克隆形成能力。為了了解干擾HOXC9是否對膠質(zhì)母細胞瘤的體內(nèi)成瘤能力有影響,我們做了小鼠皮下成瘤實驗。我們用到兩種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系,注射于小鼠背部靠臀側(cè),左側(cè)臀注射Control細胞,右側(cè)臀注射sh HOXC9細胞。從實驗結(jié)果我們可以看到,干擾HOXC9的表達可以明顯抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的體內(nèi)成瘤能力。此外,我們還通過NOD/SCID小鼠腦原位注射來測定膠質(zhì)母細胞瘤細胞體內(nèi)成瘤能力。從實驗結(jié)果我們可以看出,sh HOXC9組在小鼠腦中幾乎不成瘤,而Control組卻形成極大的腫瘤,此外,sh HOXC9組小鼠的存活率要明顯高于Control組。以上數(shù)據(jù)充分說明,干擾HOXC9的表達可強力抑制膠質(zhì)母細胞瘤的體內(nèi)成瘤能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.4

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本文編號：2304680