【摘要】：酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是一類由胞外高濃度質子(H+)激活的陽離子通道,廣泛表達于中樞和外周神經系統(tǒng),近年來被證明廣泛參與突觸傳遞與樹突棘發(fā)育,視覺感受,學習與記憶,恐懼相關行為等生理過程和傷害性感受、腦缺血、癲癇、神經退行性疾病等病理過程。通常認為ASICs是通過在細胞膜表面感受胞外化學信號(p H值的波動),介導胞外陽離子內流,從而影響神經元細胞膜的極化性質乃至神經元的興奮性。ASIC1a是酸敏感離子通道家族的重要亞單位成員,分布廣且參與多種重要的生理及病理過程。本課題就以ASIC1a為研究對象,探討了其與門控開放機制密切相關的胞內氨基酸位點、常用抗癲癇藥物對其的功能調控及其在慢性癲癇發(fā)生過程中所發(fā)揮的作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a胞內羧基端(carboxyl-terminus,C-terminus)具有很多調控位點參與了通道蛋白的表達及開放機制,而對于胞內氨基端(amino-terminus,N-terminus)的研究較少,因此我們首先對ASIC1a的胞內氨基端與其膜上表達及門控開放之間的聯(lián)系進行了探索,通過不同的刪除/截短/突變策略,發(fā)現(xiàn)N-terminus整體參與了ASIC1a的膜上表達,沒有某一個或某幾個氨基酸殘基特別的重要。在門控開放的研究中,除了發(fā)現(xiàn)文獻報道過的第21位到第41位的氨基酸膜體參與通道的開放之外,新發(fā)現(xiàn)了從第17到第20位的總共5個氨基酸殘基參與了ASIC1a的門控開放,其中又以第18位的異亮氨酸殘基最為重要。這一發(fā)現(xiàn)補充了ASICs研究領域中關于結構功能關系研究的成果。同時這也為我們設計開發(fā)新的調控ASIC1a功能的藥物提供了新的備選靶點。ASIC1a作為一種配體門控的陽離子通道參與了很多生理及病理過程,有研究報道很多臨床上使用的藥物如非甾體抗炎藥、麻醉劑利多卡因、氨基糖甙類抗生素等對其具有調控作用,提示ASIC1a很可能是這些藥物藥理作用的靶點之一。同時,ASIC1a已被報道明確參與了癲癇、神經痛等病理過程,而目前臨床上治療這兩類疾病的相關藥物大部分都是離子通道的調節(jié)劑,我們于是篩選了六種常用抗癲癇藥物,研究它們是否調控了ASIC1a的功能。通過在原代培養(yǎng)的神經元和轉染ASICs質粒的中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細胞系上進行電生理研究,我們發(fā)現(xiàn)拉莫三嗪(lamotrigine,LTG)能夠抑制ASIC1a的電流而托吡酯(topiramate,TPM)能夠增強其電流,并且這兩種藥物的調控作用都具有亞單位選擇性、濃度依賴性及通道開放狀態(tài)依賴性。這提示我們ASIC1a很可能是這些藥物作用機制的潛在靶點,而且這兩種藥物對其截然不同的調節(jié)作用提示我們兩者藥理作用的不同(比如對認知功能的影響)很可能就是由于對ASIC1a的不同調控所導致的。關于ASIC1a在癲癇中的作用尚無統(tǒng)一的結論,有文獻報道ASIC1a在癲癇發(fā)作的終止機制中發(fā)揮了功能,但也有實驗發(fā)現(xiàn)通過藥物阻斷ASIC1a能夠抑制癲癇發(fā)作的誘導過程,并且已有的研究大多針對急性癲癇發(fā)作而展開的,關于ASIC1a在慢性癲癇發(fā)生過程中其扮演的角色尚未被明確,而慢性癲癇才是臨床上醫(yī)患都最為關心的。于是我們采用鋰-匹羅卡品慢性癲癇模型研究了ASIC1a功能角色。發(fā)現(xiàn)阻斷了ASIC1a的功能后慢性癲癇發(fā)生的過程也受到了抑制,并使動物的工作記憶能力得到改善,進一步的研究發(fā)現(xiàn)慢性癲癇發(fā)生過程中星形膠質細胞上的ASIC1a表達大量增加而非神經元,這就給了我們很大的提示:腦損傷后慢性癲癇形成過程中星形膠質細胞大量增生、激活,使ASIC1a表達增加,而后者的功能上調很可能進一步增強了星形膠質細胞的功能異常而促進慢性癲癇的形成。這就為今后研究癲癇發(fā)生機制提供了新的研究方向,為制定新的抗癲癇發(fā)生策略提供了理論基礎。通過關于ASIC1a從基礎到應用的三方面研究,為我們進一步理解ASIC1a的結構功能關系提供了新的信息,并為設計調控藥物提供了備選靶點;不同藥物的不同調控作用則提示我們拉莫三嗪和托吡酯這兩種抗癲癇藥物作用效果的不同很可能就是由于對ASIC1a的不同調控所導致的;更重要的是我們發(fā)現(xiàn)慢性癲癇發(fā)生過程中星形膠質細胞上ASIC1a表達的增加與ASIC1a的拮抗劑具有抗癲癇發(fā)生的作用,為我們提供了一個探索癲癇發(fā)生機制的新領域。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1
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本文編號：2304870