【摘要】：背景與目的卒中是世界范圍內(nèi)第四位致死原因,是中國人群第一位致死和致殘原因。缺血性卒中由于血管閉塞引起供血區(qū)域氧、糖供應(yīng)障礙,引起二級損傷級聯(lián)瀑布,導(dǎo)致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞死亡。目前只有組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)是具有循證醫(yī)學(xué)依據(jù)的急性卒中治療手段。但尚沒有其他神經(jīng)保護(hù)或者神經(jīng)修復(fù)治療手段被證明是有效的,所以尋找新型、有效的神經(jīng)保護(hù)、修復(fù)手段非常有必要。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展,人類胚胎干細(xì)胞/多能誘導(dǎo)干細(xì)胞已被證明能分化成各種類型的神經(jīng)元,為其在卒中細(xì)胞治療中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。可行的思路是通過移植具有神經(jīng)元分化能力的神經(jīng)前體細(xì)胞、重建卒中后受損腦組織的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。研究證實神經(jīng)前體細(xì)胞移植后能在腦組織中分化成神經(jīng)元并且促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)的效果。然后目前限制人胚胎干細(xì)胞/多能誘導(dǎo)干細(xì)胞來源的神經(jīng)前體細(xì)胞向臨床轉(zhuǎn)化的一大難題是,神經(jīng)前體細(xì)胞一方面在移植后存活比例低,而存活細(xì)胞具有強(qiáng)大增殖活性,有導(dǎo)致腫瘤形成風(fēng)險。有報道稱γ-分泌酶抑制劑抑制Notch通路是卒中細(xì)胞治療優(yōu)化的可行手段。Notch是調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化的重要分子,干擾Notch是調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖與分化的一個新穎思路。缺血預(yù)適應(yīng)被普遍認(rèn)為是提高細(xì)胞對致死性打擊的承受能力的手段。我們的前期數(shù)據(jù)表明Botch是介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)神經(jīng)保護(hù)作用的核心分子。而另一方面,最新研究表明,Botch是內(nèi)源性的Notch抑制劑；可以通過限制Notch的furin樣轉(zhuǎn)化抑制Notch分子的剪切成熟和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。基于這些基礎(chǔ),我們嘗試通過在神經(jīng)前體細(xì)胞過表達(dá)Botch來調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞在體外和移植后的存活、增殖和分化,考察Botch過表達(dá)是否是增加細(xì)胞移植神經(jīng)修復(fù)功能的有效方法。材料與方法1.通過轉(zhuǎn)座子技術(shù)使得人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)系H1能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)或者紅色熒光蛋白(dsRed)。利用雙細(xì)胞移植體系統(tǒng),對神經(jīng)前體細(xì)胞(human neural precursor cells, hNPCs)階段的dsRed陽性hNPCs給予OGD或者NMDA預(yù)處理,而EGFP陽性hNPCs不做處理作為對照。兩種細(xì)胞等量均勻混合后移植入卒中1天后的免疫缺陷小鼠梗塞皮質(zhì)。通過熒光信號可以追蹤移植細(xì)胞團(tuán)的體積和形態(tài)成熟,通過免疫熒光染色考察細(xì)胞的增殖和存活。2.通過對缺血預(yù)處理過的人NPCs進(jìn)行RNA測序篩選,并且結(jié)合前期工作基礎(chǔ),我們認(rèn)為Botch可能是介導(dǎo)缺血預(yù)處理和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的有效靶點。通過實時定量PCR技術(shù)考察Botch在不同階段人類細(xì)胞的表達(dá)譜,通過westernblot考察Botch在細(xì)胞、組織中的表達(dá)。3.通過慢病毒載體在hNPCs過表達(dá)Botch-EGFP,或者表達(dá)EGFP作為對照。Western blot確認(rèn)過表達(dá)效率。Botch過表達(dá)對細(xì)胞增殖、死亡和成熟皮層神經(jīng)元分化的作用通過免疫熒光染色鑒定。4.在體內(nèi)細(xì)胞移植實驗中,我們將過表達(dá)Botch的人NPCs或者對照hNPCs移植入卒中后1天的免疫缺陷NSG小鼠梗塞皮層。通過綠色熒光信號觀察移植細(xì)胞團(tuán)的體積、移植細(xì)胞的分布和突起形成。通過免疫熒光染色觀察細(xì)胞在梗塞皮層的存活、增殖和向神經(jīng)元的分化及整合。通過階梯食物獲取實驗和意面獲取實驗觀察Botch過表達(dá)的hNPCs能否促進(jìn)卒中小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。結(jié)果1.缺血預(yù)適應(yīng)可以限制移植人神經(jīng)前體細(xì)胞(human neural precursor cells, hNPCs)在梗塞皮層的增殖：我們連續(xù)觀察了雙細(xì)胞系統(tǒng)移植后4周、8周、12周和16周的移植物體積、密度、移植細(xì)胞增殖和存活情況。結(jié)果表明盡管OGD/NMDA缺血預(yù)適應(yīng)沒能顯著抑制移植物體積或者改善移植細(xì)胞的存活,但是可以短暫抑制細(xì)胞Ki67+的比例,以及降低移植細(xì)胞的密度。2. Botch可能是缺血預(yù)適應(yīng)的關(guān)鍵分子：我們的RNA測序結(jié)果提示,Botch在OGD預(yù)處理和NMDA預(yù)處理后的hNPCs中表達(dá)上升。在hESCs向EB、hNPCs和神經(jīng)元分化的過程中,hNPCs階段Botch基因表達(dá)和蛋白水平最低。另外也有證據(jù)提示抑制Botch可以抵消缺血預(yù)適應(yīng)的效應(yīng)。3. Botch過表達(dá)可以抑制人神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、促進(jìn)分化,并對神經(jīng)元提供神經(jīng)保護(hù)：我們對分化到神經(jīng)前體細(xì)胞階段的hESCs來源的hNPCs進(jìn)行慢病毒載體感染,過表達(dá)Botch-EGFP或者EGFP。結(jié)果提示Botch過表達(dá)能抑制神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞的增殖能力,但對細(xì)胞的存活不造成壓力；并促進(jìn)hNPCs向MAP2+成熟神經(jīng)元、Tbrl+或者Ctip2+深層皮層神經(jīng)元以及Gad67+抑制性神經(jīng)元的分化。此外,hESCs來源的神經(jīng)元過表達(dá)Botch可以顯著提高神經(jīng)元對致死性O(shè)GD損傷或者NMDA損傷的抵抗能力。4. Botch過表達(dá)限制移植hNPCs的過度增殖、促進(jìn)分化和卒中后的神經(jīng)功能恢復(fù)：體內(nèi)細(xì)胞移植結(jié)果提示,Botch過表達(dá)能夠降低移植后4周、8周細(xì)胞內(nèi)的Ki67+比例并且限制移植物的體積過度增殖。同時Botch過表達(dá)能降低caspase3+細(xì)胞的比例,提示細(xì)胞存活得到改善。Botch過表達(dá)不影響移植細(xì)胞投射到皮質(zhì)、胼胝體以及紋狀體的投射,但能夠顯著促進(jìn)hNPCs分化而來的神經(jīng)元的突起長度。就皮層神經(jīng)元分化角度,Botch過表達(dá)能促進(jìn)移植的hNPCs向Tbrl+、Ctip2+皮層神經(jīng)元分化。最重要的是,過表達(dá)Botch的神經(jīng)前體細(xì)胞移植能夠顯著促進(jìn)卒中后小鼠的精細(xì)運動功能的恢復(fù)。結(jié)論與意義1.缺血預(yù)適應(yīng)能夠短暫限制移植物增殖：我們用雙細(xì)胞系統(tǒng)移植體系,避免了個體差異帶來的實驗誤差。結(jié)果提示缺血預(yù)適應(yīng)沒有能夠顯著促進(jìn)移植細(xì)胞的存活,這可能與缺血預(yù)適應(yīng)的作用具有短時性有關(guān)。但是缺血預(yù)適應(yīng)能夠顯著抑制移植早期的細(xì)胞增殖,從而降低移植物內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。2. Botch介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)效應(yīng)的關(guān)鍵分子：缺血預(yù)適應(yīng)效果具有短時性和局限性,我們通過RNAseq等技術(shù)篩選出Botch,并在功能實驗中證實Botch是介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)的核心分子。此外,在hNPCs階段Botch表達(dá)水平最低,我們預(yù)測可以通過在hNPCs階段過表達(dá)Botch調(diào)控其存活、增殖、分化。3. Botch過表達(dá)抑制hNPCs增殖、提供神經(jīng)保護(hù)并且促進(jìn)神經(jīng)元分化：我們的結(jié)果提示Botch對不同分化階段的細(xì)胞具有不同作用。Botch通過抑制Notch信號通路,抑制具有高度增殖活性的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其向皮層神經(jīng)元的分化；但對分化成熟的神經(jīng)元增加其對缺血打擊的承受能力。同時,Botch過表達(dá)可以提高神經(jīng)前體細(xì)胞向成熟神經(jīng)元和深層皮層神經(jīng)元、抑制性神經(jīng)元的分化。Botch的這些特性共同提示Botch可能是提高細(xì)胞移植安全性、有效性的重要靶點。4. Botch過表達(dá)提高細(xì)胞移植安全性、促進(jìn)神經(jīng)元分化和功能恢復(fù)：過表達(dá)Botch的hNPCs在移植入小鼠梗塞皮層后過度增殖得到抑制,同時成熟細(xì)胞存活得到改善。移植細(xì)胞可以向深層皮層神經(jīng)元分化,并且能形成突觸結(jié)構(gòu)。更重要的是過表達(dá)Botch的hNPCs移植可以顯著加速卒中后小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù),這可能跟Botch提高神經(jīng)元存活、促進(jìn)抑制性神經(jīng)元分化中和興奮性損傷有關(guān)。這些結(jié)果共同提示Botch可以通過對不同階段的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮不同效應(yīng),使得hNPCs移植更加安全、有效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

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本文編號：2303961