【摘要】：癲癇腦內(nèi)突觸連接發(fā)生持久的結(jié)構(gòu)性改變是癲癇形成的病理機(jī)制之一。肌動(dòng)蛋白纖維的解聚和聚合是突觸重塑的主要驅(qū)動(dòng)力。但是由于缺乏理想的檢測(cè)手段，目前對(duì)癲癇中F-actin機(jī)制研究甚少。本研究通過C57BL/6小鼠的匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)后模型、戊四唑化學(xué)點(diǎn)燃模型，采用Phalloidin特異標(biāo)記F-actin，結(jié)合突觸前后標(biāo)記及蛋白檢測(cè)方法，，研究F-actin在癲癇病理進(jìn)程中的變化規(guī)律，進(jìn)一步明確癲癇的發(fā)病機(jī)制，以期為臨床治療癲癇提供新的方向。 目的：研究F-actin在癲癇病理進(jìn)程中的變化規(guī)律，為攻克癲癇提供新的理論依據(jù)。 方法：采用C57BL/6小鼠，制備兩種顳葉癲癇模型—匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)后自發(fā)性發(fā)作模型和PTZ化學(xué)點(diǎn)燃模型，應(yīng)用phalloidin特異性標(biāo)記小鼠海馬F-actin，采用synapsin I、PSD95抗體進(jìn)行突觸前、后標(biāo)記，利用F-actin/synapsinI和F-actin/PSD95雙重染色分析F-actin在突觸前后分布，結(jié)合F/G比值測(cè)定、PSD95、synapsin I、cofilin、p-cofilin Western Blot分析，研究F-actin在顳葉癲癇模型中的變化規(guī)律。 結(jié)果： 1.匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)后模型： （1）模型成功率：160只小鼠中，62.5%（100/160）達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)，其中19只存活，成功率為11.88%（19/160），死亡率50.62%（81/160）。所有達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)并存活的小鼠在2個(gè)月后均觀察到了自發(fā)性發(fā)作現(xiàn)象。 （2）C57BL/6小鼠匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)后模型急性期、靜止期及慢性期F-actin表達(dá)變化：在模型急性期（6小時(shí)）,F-actin熒光強(qiáng)度明顯降低；而在靜止期（48小時(shí)、10天），F(xiàn)-actin染色熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)；在慢性期（癲癇持續(xù)狀態(tài)后2個(gè)月），F(xiàn)-actin熒光強(qiáng)度再一次降低，并且F-actin陽性顆粒的形態(tài)及分布發(fā)生了變化。 （3）匹魯卡品模型慢性期Nissl、Timm、GFAP染色結(jié)果：Nissl染色結(jié)果顯示與對(duì)照小鼠相比，匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)后小鼠的海馬CA1-CA3區(qū)錐體細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞缺失，而齒狀回顆粒細(xì)胞出現(xiàn)了明顯增生（p0.05）。Timm染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠齒狀回出現(xiàn)苔蘚纖維發(fā)芽，齒狀回內(nèi)分子層Timm染色陽性顆粒較對(duì)照組明顯增多（p0.05）。 GFAP染色顯示匹魯卡品模型慢性期海馬CA3區(qū)GFAP染色明顯增強(qiáng)(p0.05)。 （4）匹魯卡品模型慢性期F-actin變化：在低倍鏡下可見實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組CA3區(qū)透明層F-actin染色的熒光強(qiáng)度略有降低。在高倍鏡下，匹魯卡品組F-actin陽性顆粒數(shù)量明顯減少并且增大。統(tǒng)計(jì)分析顯示實(shí)驗(yàn)組每平方微米的陽性面積和陽性數(shù)目較對(duì)照組顯著減少（p0.05）。但平均每個(gè)F-actin顆粒的面積明顯增大（p0.05）。Western blot結(jié)果顯示匹魯卡品組小鼠海馬F/G比值較對(duì)照組顯著下調(diào)（p0.05）。 （5）匹魯卡品模型慢性期synapsin I染色及Western blot結(jié)果：在低倍鏡下，可見實(shí)驗(yàn)組CA3區(qū)透明層synapsin I染色熒光強(qiáng)度較對(duì)照組略有降低。在高倍鏡下，可見實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組synapsin I顆粒明顯增大，數(shù)量明顯減少。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組每平方微米的陽性面積與對(duì)照組無顯著差異（p0.05）。但陽性數(shù)目明顯減少、平均每個(gè)synapsin I顆粒的面積明顯增大（p0.05）。Western blot數(shù)據(jù)顯示，匹魯卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)后小鼠海馬synapsin I表達(dá)變化不明顯（p0.05）。 （6）匹魯卡品模型慢性期PSD95染色及Western blot結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CA3區(qū)透明層的PSD95每平方微米陽性面積明顯減少（p0.05）。Westernblot數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，點(diǎn)燃組PSD95表達(dá)明顯下調(diào)（p0.05）。 （7）匹魯卡品模型慢性期F-actin/synapsin I和F-actin/PSD95雙重染色結(jié)果：F-actin與synapsin I雙重染色結(jié)果顯示二者共存的總面積在實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯減少，而二者在每處共存的面積卻明顯增大（p0.05）。F-actin與PSD95的雙重染色顯示，PSD95陽性顆粒與F-actin陽性顆粒大部分重合。 2. PTZ化學(xué)點(diǎn)燃模型： （1）模型成功率：在每日給藥組，80%（12/15）小鼠被成功點(diǎn)燃，平均時(shí)間為19.7+/-5.3天（n=12）；每隔48小時(shí)注射組，只有46.7%（7/15）小鼠被成功點(diǎn)燃，平均給藥次數(shù)為30.0+/-20.3次（n=7）。 （2）Nissl和Timm染色結(jié)果：Nissl染色結(jié)果顯示PTZ點(diǎn)燃小鼠的海馬CA1-CA3區(qū)錐體細(xì)胞只出現(xiàn)了輕度細(xì)胞缺失，CA3b區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析顯示組間無顯著性差異（p0.05）。Timm染色結(jié)果顯示PTZ點(diǎn)燃小鼠齒狀回及CA3區(qū)未出現(xiàn)苔蘚纖維發(fā)芽。而在CA3區(qū)透明層，點(diǎn)燃組小鼠Timm染色加深（p0.05）。 （3）F-actin標(biāo)記及F/G比值測(cè)定結(jié)果：在高倍鏡下，點(diǎn)燃小鼠CA3區(qū)透明層F-actin陽性顆粒數(shù)目明顯增多。統(tǒng)計(jì)分析顯示點(diǎn)燃組的F-actin每平方微米的陽性面積和陽性數(shù)目較對(duì)照組顯著增加（p0.05）。Western blot數(shù)據(jù)顯示，點(diǎn)燃組的F/G比值顯著上調(diào)（p0.05）。 （4）synapsin I免疫組化染色及Western blot結(jié)果：高倍鏡下可見點(diǎn)燃組CA3區(qū)透明層synapsin I染色的陽性面積和每個(gè)顆粒大小與對(duì)照組相比明顯增加。統(tǒng)計(jì)分析顯示兩組間差異性顯著（p0.05）。Western blot分析結(jié)果也顯示點(diǎn)燃組synapsin I的表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)（p0.05）。 （5）PSD95免疫組化染色及Western blot結(jié)果：點(diǎn)燃組CA3區(qū)透明層的PSD95熒光強(qiáng)度明顯降低，統(tǒng)計(jì)分析顯示PSD95每平方微米陽性面積顯著降低（p0.05）。Western blot數(shù)據(jù)顯示點(diǎn)燃組PSD95表達(dá)明顯下調(diào)（p0.05）。 （6）F-actin/synapsin I和F-actin/PSD95雙重染色結(jié)果：F-actin與synapsin I雙重染色顯示，在CA3區(qū)透明層，在高倍鏡下可見到Factin染色陽區(qū)（綠色）有一條窄帶與synapsin I陽性區(qū)（紅色）周圍相重合（黃色），與對(duì)照組相比，點(diǎn)燃組黃色面積明顯增加（p0.05）。F-actin與PSD95的雙重染色顯示，PSD95陽性顆粒與F-actin陽性顆粒大部分重合，但二者分布并不完全一致。 結(jié)論： （1）在C57BL/6小鼠苔蘚纖維末端突觸，F(xiàn)-actin與synapsin I共存于突觸前區(qū)； （2）匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)后，在模型急性期，CA3區(qū)透明層F-actin熒光強(qiáng)度明顯降低；而在靜止期，F(xiàn)-actin染色熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)；在慢性期，F(xiàn)-actin熒光強(qiáng)度再一次降低，并伴有形態(tài)改變； （3）匹魯卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)后模型慢性期，C57BL/6小鼠海馬出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元缺失及齒狀回苔蘚纖維發(fā)芽、膠質(zhì)細(xì)胞增生； （4）匹魯卡品模型慢性期，C57BL/6小鼠CA3區(qū)透明層F-actin下降及形態(tài)學(xué)重構(gòu)主要發(fā)生在突觸后區(qū)，并可能與模型慢性期的自發(fā)性發(fā)作密切相關(guān)； （5）PTZ點(diǎn)燃未引起引起C57BL/6小鼠海馬明顯的神經(jīng)元缺失及苔蘚纖維發(fā)芽； （6）點(diǎn)燃后C57BL/6小鼠CA3區(qū)透明層F-actin在突觸前后表現(xiàn)出差異性重構(gòu)—在突觸前表達(dá)增多，在突觸后表達(dá)減少。這種重構(gòu)的結(jié)果很可能與點(diǎn)燃模型的驚厥易感性有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：2303707