【摘要】：研究目的:谷氨酸和過(guò)度激活的NMDA受體結(jié)合所介導(dǎo)的興奮毒損傷作用是腦卒中等腦組織缺血性疾病主要的病理生理機(jī)制。在過(guò)去的幾十年中,NMDA受體阻滯劑被廣泛的用于腦卒中、阿爾茲海默癥等神經(jīng)精神性疾病的干預(yù)性研究中,然而由于其嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)副作用,多數(shù)NMDA受體阻滯劑在相關(guān)臨床研究中均以失敗告終。近年來(lái)相關(guān)研究表明在腦卒中發(fā)生后的數(shù)小時(shí)乃至數(shù)日內(nèi)的腦組織中普遍存在神經(jīng)元受損以及NMDA受體功能減退等表現(xiàn),鑒于此本研究另辟蹊徑試圖通過(guò)調(diào)節(jié)NMDA受體活性這一手段抑制興奮毒損傷作用并提升和改善腦卒中后的NMDA受體功能。本論文中所研究的干預(yù)性藥物GLYX-13(rapastinel)是一種NMDA受體甘氨酸位點(diǎn)的調(diào)節(jié)劑,有相關(guān)研究表明該藥物對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)性且毒副作用較小,然而至今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)GLYX-13改善缺血性神經(jīng)元損傷作用機(jī)制的研究報(bào)道。據(jù)此,本研究在小鼠在體大腦中動(dòng)脈阻塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO模型)以及離體腦片氧葡萄糖剝奪模型(Oxygen Glucose Deprivation,OGD模型)的基礎(chǔ)上,通過(guò)觀察GLYX-13對(duì)腦組織缺血/缺氧后有無(wú)神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及其對(duì)NMDA受體功能和突觸可塑性的影響,探討該藥物對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷的保護(hù)性作用機(jī)制及其途徑,為臨床治療腦卒中提供創(chuàng)新思路和方法。研究方法:1.探索GLYX-13對(duì)在體MCAO模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)性作用,研究方法如下:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:2月齡體重20-25g雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組,即假手術(shù)組(Sham)、MCAO模型給予生理鹽水對(duì)照組(Vehicle)、MCAO模型給予GLYX-13干預(yù)組(GLYX-13)。(2)MCAO模型小鼠的制備:采用硅膠線栓法阻塞小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈供應(yīng)區(qū)血流,線栓阻塞血流時(shí)間為60min。(3)MCAO模型腦血流量檢測(cè):應(yīng)用激光多普勒血流檢測(cè)儀對(duì)造模前后小鼠的大腦中動(dòng)脈中央供應(yīng)區(qū)血流量進(jìn)行檢測(cè),只有造模后腦血流量小于或等于造模前基線水平20%的小鼠方能被納入后續(xù)研究。(4)應(yīng)用GLYX-13干預(yù):于MCAO術(shù)后兩小時(shí)經(jīng)腹腔注射給予GLYX-13干預(yù)組小鼠10mg/kg的GLYX-13。(5)神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分:參考Longa神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分對(duì)以上3組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。(6)腦組織梗塞范圍的檢測(cè):應(yīng)用TTC染色檢測(cè)3組小鼠的腦組織梗塞范圍。(7)腦組織海馬神經(jīng)元損傷程度檢測(cè):應(yīng)用腦組織石蠟切片HE染色以及Fluoro Jade C染色檢測(cè)3組小鼠海馬神經(jīng)元的損傷。2.探討GLYX-13對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷的保護(hù)性作用機(jī)制,研究方法如下:(1)腦組織中NMDA受體含量及其磷酸化水平的檢測(cè):應(yīng)用Western blot檢測(cè)再灌注4h以及24h后3組小鼠腦組織中NR2A、NR2B、p-NR2A(Tyr1325)以及p-NR2B(Tyr1472)的表達(dá)。(2)電生理腦片全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)分組:4周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組,即對(duì)照組(Con)、腦片OGD模型組、腦片OGD同時(shí)給予GLYX-13干預(yù)組(OGD+GLYX-13)、腦片OGD同時(shí)給予GLYX-13和NMDA受體甘氨酸位點(diǎn)全效激動(dòng)劑D-serine干預(yù)組(OGD+GLYX-13+D-serine)。(2)離體腦片OGD模型的制備:用于模擬腦組織缺血后能量供應(yīng)缺乏這一情況,采用被95%N2+5%CO2的混合氣所飽和的人工腦脊液(ACSF)來(lái)灌流腦片,并且這種ACSF中的10mmol/L的葡萄糖被同濃度的蔗糖所替代。對(duì)腦片施加OGD的持續(xù)時(shí)間為5min。(3)誘發(fā)性的興奮性突觸后電流(EPSC)的檢測(cè):電刺激海馬腦片shaffer側(cè)枝并應(yīng)用電生理腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別記錄4組腦片海馬CA3-CA1 shaffer collateral通路EPSC、NMDA-EPSC以及NR2A和NR2B亞型所介導(dǎo)的EPSC的幅值。(3)在體MCAO模型腦組織梗塞范圍的檢測(cè):應(yīng)用TTC染色檢測(cè)GLYX-13+D-serine處理組、GLYX-13+NVP-AAM077(特異性NR2A亞型拮抗劑)處理組以及GLYX-13+Ro256981(特異性NR2B亞型拮抗劑)處理組小鼠的腦組織梗塞體積,并將其結(jié)果與本研究第二章節(jié)中的TTC染色結(jié)果進(jìn)行比較,進(jìn)一步證實(shí)GLYX-13很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NMDA受體NR2亞基組分這一途徑從而發(fā)揮對(duì)病理性突觸可塑性的抑制作用以及神經(jīng)保護(hù)作用這一猜想。研究結(jié)果:1.GLYX-13對(duì)在體MCAO模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)性作用(1)GLYX-13改善了小鼠缺血再灌注24h后的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分:GLYX-13干預(yù)組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于鹽水對(duì)照組(n=12,***p0.001)。(2)GLYX-13減少了小鼠腦缺血再灌注24h后的腦梗塞體積:與鹽水對(duì)照組相比,GLYX-13干預(yù)組小鼠的腦梗塞體積顯著減少(n=12,###p0.001)。(3)GLYX-13減輕了小鼠缺血再灌注24h后患側(cè)海馬神經(jīng)元的損傷:與鹽水對(duì)照組相比,GLYX-13干預(yù)組小鼠患側(cè)海馬CA3區(qū)以及DG區(qū)Fluoro Jade C陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少(###p0.001,n=5),此外CA1區(qū)Fluoro Jade C陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量也低于鹽水對(duì)照組(#p0.05,n=5)。2.GLYX-13通過(guò)差異性調(diào)節(jié)NMDA受體NR2亞基進(jìn)而對(duì)損傷腦組織發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)性作用。(1)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果:GLYX-13顯著地下調(diào)了MCAO小鼠再灌注4h后腦組織中的p-NR2B(Tyr1472)的表達(dá)(#p0.05,n=6)并且上調(diào)了p-NR2A(Tyr1325)的表達(dá)(#p0.05,n=6);此外缺血再灌注24h后的小鼠受損傷影響其腦組織中NR2A型NMDA受體的表達(dá)明顯減少而GLYX-13的干預(yù)有效地預(yù)防了NR2A亞型的損失(#p0.05,n=6)使得該亞型所介導(dǎo)的正常神經(jīng)生理功能得以維持。(2)腦片全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)GLYX-13通過(guò)激活NMDA受體的甘氨酸輔助激動(dòng)位點(diǎn)對(duì)抗腦組織缺氧時(shí)所產(chǎn)生的病理性的突觸可塑性增強(qiáng)(post-ischemic Long Term Potentiation,i-LTP):長(zhǎng)達(dá)5min的OGD使得海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元在恢復(fù)能量供應(yīng)后的EPSC的幅值顯著持續(xù)增高(n=5,**p0.01),并且這種由OGD所誘導(dǎo)的EPSC病理性增益的現(xiàn)象可被特異性的NMDA受體拮抗劑AP-5所阻斷,即證實(shí)了這種i-LTP的產(chǎn)生需要NMDA受體的參與。而GLYX-13干預(yù)組經(jīng)歷同樣時(shí)長(zhǎng)的OGD后其海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元在恢復(fù)能量供應(yīng)后的EPSC的幅值明顯低于單純OGD損傷組(n=5,##p0.01),并且D-serine能夠完全抵消GLYX-13對(duì)于i-LTP的抑制效應(yīng)。(2)GLYX-13參與調(diào)節(jié)腦組織能量剝奪條件下NMDA受體亞基的組成:給予海馬腦片長(zhǎng)達(dá)5min的OGD處理后,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元含有NR2B亞基的NMDA受體所介導(dǎo)的EPSC的幅值顯著增高并同時(shí)伴隨著總的NMDA-EPSC幅值的增高(n=5,**p0.01),而含有NR2A亞基的NMDA受體介導(dǎo)的EPSC的幅值只有輕微增高,與對(duì)照組的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。值得注意的是GLYX-13干預(yù)組NR2B-EPSC以及NMDA-EPSC的幅值顯著低于單純OGD損傷組(n=5,##p0.01)。(3)在體MCAO模型TTC染色結(jié)果:(GLYX-13+Ro256981)處理組與單純GLYX-13干預(yù)組相比未能表現(xiàn)出額外的神經(jīng)保護(hù)性效應(yīng)(n=6,p0.05);而(GLYX-13+NVP-AAM077)處理組和(GLYX-13+D-serine)處理組分別與MCAO模型鹽水對(duì)照組相比并未表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)性效應(yīng)(n=6,p0.05)。即NMDA受體甘氨酸位點(diǎn)全效激動(dòng)劑以及NR2A亞基的特異性拮抗劑的應(yīng)用均能夠消除GLYX-13對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷的改善作用。這便進(jìn)一步證實(shí)了GLYX-13是通過(guò)作用于NMDA受體的甘氨酸輔助激動(dòng)位點(diǎn)調(diào)節(jié)NMDA受體的NR2亞基構(gòu)成從而發(fā)揮對(duì)缺血性神經(jīng)元損傷的保護(hù)性作用。結(jié)論:1、GLYX-13對(duì)MCAO模型小鼠具有神經(jīng)保護(hù)性。2、GLYX-13通過(guò)對(duì)NMDA受體NR2亞基的差異性調(diào)節(jié)對(duì)腦缺血性神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)性作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743

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