【摘要】：研究目的:谷氨酸和過度激活的NMDA受體結(jié)合所介導(dǎo)的興奮毒損傷作用是腦卒中等腦組織缺血性疾病主要的病理生理機制。在過去的幾十年中,NMDA受體阻滯劑被廣泛的用于腦卒中、阿爾茲海默癥等神經(jīng)精神性疾病的干預(yù)性研究中,然而由于其嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)副作用,多數(shù)NMDA受體阻滯劑在相關(guān)臨床研究中均以失敗告終。近年來相關(guān)研究表明在腦卒中發(fā)生后的數(shù)小時乃至數(shù)日內(nèi)的腦組織中普遍存在神經(jīng)元受損以及NMDA受體功能減退等表現(xiàn),鑒于此本研究另辟蹊徑試圖通過調(diào)節(jié)NMDA受體活性這一手段抑制興奮毒損傷作用并提升和改善腦卒中后的NMDA受體功能。本論文中所研究的干預(yù)性藥物GLYX-13(rapastinel)是一種NMDA受體甘氨酸位點的調(diào)節(jié)劑,有相關(guān)研究表明該藥物對神經(jīng)元具有保護性且毒副作用較小,然而至今國內(nèi)外尚無GLYX-13改善缺血性神經(jīng)元損傷作用機制的研究報道。據(jù)此,本研究在小鼠在體大腦中動脈阻塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO模型)以及離體腦片氧葡萄糖剝奪模型(Oxygen Glucose Deprivation,OGD模型)的基礎(chǔ)上,通過觀察GLYX-13對腦組織缺血/缺氧后有無神經(jīng)保護效應(yīng)及其對NMDA受體功能和突觸可塑性的影響,探討該藥物對缺血性神經(jīng)元損傷的保護性作用機制及其途徑,為臨床治療腦卒中提供創(chuàng)新思路和方法。研究方法:1.探索GLYX-13對在體MCAO模型小鼠的神經(jīng)保護性作用,研究方法如下:(1)實驗動物分組:2月齡體重20-25g雄性C57BL/6小鼠隨機分為3組,即假手術(shù)組(Sham)、MCAO模型給予生理鹽水對照組(Vehicle)、MCAO模型給予GLYX-13干預(yù)組(GLYX-13)。(2)MCAO模型小鼠的制備:采用硅膠線栓法阻塞小鼠右側(cè)大腦中動脈供應(yīng)區(qū)血流,線栓阻塞血流時間為60min。(3)MCAO模型腦血流量檢測:應(yīng)用激光多普勒血流檢測儀對造模前后小鼠的大腦中動脈中央供應(yīng)區(qū)血流量進行檢測,只有造模后腦血流量小于或等于造模前基線水平20%的小鼠方能被納入后續(xù)研究。(4)應(yīng)用GLYX-13干預(yù):于MCAO術(shù)后兩小時經(jīng)腹腔注射給予GLYX-13干預(yù)組小鼠10mg/kg的GLYX-13。(5)神經(jīng)功能學(xué)評分:參考Longa神經(jīng)功能學(xué)評分對以上3組小鼠進行神經(jīng)功能評估。(6)腦組織梗塞范圍的檢測:應(yīng)用TTC染色檢測3組小鼠的腦組織梗塞范圍。(7)腦組織海馬神經(jīng)元損傷程度檢測:應(yīng)用腦組織石蠟切片HE染色以及Fluoro Jade C染色檢測3組小鼠海馬神經(jīng)元的損傷。2.探討GLYX-13對缺血性神經(jīng)元損傷的保護性作用機制,研究方法如下:(1)腦組織中NMDA受體含量及其磷酸化水平的檢測:應(yīng)用Western blot檢測再灌注4h以及24h后3組小鼠腦組織中NR2A、NR2B、p-NR2A(Tyr1325)以及p-NR2B(Tyr1472)的表達(dá)。(2)電生理腦片全細(xì)胞膜片鉗實驗(1)實驗分組:4周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組,即對照組(Con)、腦片OGD模型組、腦片OGD同時給予GLYX-13干預(yù)組(OGD+GLYX-13)、腦片OGD同時給予GLYX-13和NMDA受體甘氨酸位點全效激動劑D-serine干預(yù)組(OGD+GLYX-13+D-serine)。(2)離體腦片OGD模型的制備:用于模擬腦組織缺血后能量供應(yīng)缺乏這一情況,采用被95%N2+5%CO2的混合氣所飽和的人工腦脊液(ACSF)來灌流腦片,并且這種ACSF中的10mmol/L的葡萄糖被同濃度的蔗糖所替代。對腦片施加OGD的持續(xù)時間為5min。(3)誘發(fā)性的興奮性突觸后電流(EPSC)的檢測:電刺激海馬腦片shaffer側(cè)枝并應(yīng)用電生理腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別記錄4組腦片海馬CA3-CA1 shaffer collateral通路EPSC、NMDA-EPSC以及NR2A和NR2B亞型所介導(dǎo)的EPSC的幅值。(3)在體MCAO模型腦組織梗塞范圍的檢測:應(yīng)用TTC染色檢測GLYX-13+D-serine處理組、GLYX-13+NVP-AAM077(特異性NR2A亞型拮抗劑)處理組以及GLYX-13+Ro256981(特異性NR2B亞型拮抗劑)處理組小鼠的腦組織梗塞體積,并將其結(jié)果與本研究第二章節(jié)中的TTC染色結(jié)果進行比較,進一步證實GLYX-13很可能是通過調(diào)節(jié)NMDA受體NR2亞基組分這一途徑從而發(fā)揮對病理性突觸可塑性的抑制作用以及神經(jīng)保護作用這一猜想。研究結(jié)果:1.GLYX-13對在體MCAO模型小鼠的神經(jīng)保護性作用(1)GLYX-13改善了小鼠缺血再灌注24h后的神經(jīng)功能學(xué)評分:GLYX-13干預(yù)組小鼠的神經(jīng)功能評分顯著低于鹽水對照組(n=12,***p0.001)。(2)GLYX-13減少了小鼠腦缺血再灌注24h后的腦梗塞體積:與鹽水對照組相比,GLYX-13干預(yù)組小鼠的腦梗塞體積顯著減少(n=12,###p0.001)。(3)GLYX-13減輕了小鼠缺血再灌注24h后患側(cè)海馬神經(jīng)元的損傷:與鹽水對照組相比,GLYX-13干預(yù)組小鼠患側(cè)海馬CA3區(qū)以及DG區(qū)Fluoro Jade C陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少(###p0.001,n=5),此外CA1區(qū)Fluoro Jade C陽性神經(jīng)元的數(shù)量也低于鹽水對照組(#p0.05,n=5)。2.GLYX-13通過差異性調(diào)節(jié)NMDA受體NR2亞基進而對損傷腦組織發(fā)揮神經(jīng)保護性作用。(1)Western blot實驗結(jié)果:GLYX-13顯著地下調(diào)了MCAO小鼠再灌注4h后腦組織中的p-NR2B(Tyr1472)的表達(dá)(#p0.05,n=6)并且上調(diào)了p-NR2A(Tyr1325)的表達(dá)(#p0.05,n=6);此外缺血再灌注24h后的小鼠受損傷影響其腦組織中NR2A型NMDA受體的表達(dá)明顯減少而GLYX-13的干預(yù)有效地預(yù)防了NR2A亞型的損失(#p0.05,n=6)使得該亞型所介導(dǎo)的正常神經(jīng)生理功能得以維持。(2)腦片全細(xì)胞膜片鉗實驗結(jié)果:(1)GLYX-13通過激活NMDA受體的甘氨酸輔助激動位點對抗腦組織缺氧時所產(chǎn)生的病理性的突觸可塑性增強(post-ischemic Long Term Potentiation,i-LTP):長達(dá)5min的OGD使得海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元在恢復(fù)能量供應(yīng)后的EPSC的幅值顯著持續(xù)增高(n=5,**p0.01),并且這種由OGD所誘導(dǎo)的EPSC病理性增益的現(xiàn)象可被特異性的NMDA受體拮抗劑AP-5所阻斷,即證實了這種i-LTP的產(chǎn)生需要NMDA受體的參與。而GLYX-13干預(yù)組經(jīng)歷同樣時長的OGD后其海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元在恢復(fù)能量供應(yīng)后的EPSC的幅值明顯低于單純OGD損傷組(n=5,##p0.01),并且D-serine能夠完全抵消GLYX-13對于i-LTP的抑制效應(yīng)。(2)GLYX-13參與調(diào)節(jié)腦組織能量剝奪條件下NMDA受體亞基的組成:給予海馬腦片長達(dá)5min的OGD處理后,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元含有NR2B亞基的NMDA受體所介導(dǎo)的EPSC的幅值顯著增高并同時伴隨著總的NMDA-EPSC幅值的增高(n=5,**p0.01),而含有NR2A亞基的NMDA受體介導(dǎo)的EPSC的幅值只有輕微增高,與對照組的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。值得注意的是GLYX-13干預(yù)組NR2B-EPSC以及NMDA-EPSC的幅值顯著低于單純OGD損傷組(n=5,##p0.01)。(3)在體MCAO模型TTC染色結(jié)果:(GLYX-13+Ro256981)處理組與單純GLYX-13干預(yù)組相比未能表現(xiàn)出額外的神經(jīng)保護性效應(yīng)(n=6,p0.05);而(GLYX-13+NVP-AAM077)處理組和(GLYX-13+D-serine)處理組分別與MCAO模型鹽水對照組相比并未表現(xiàn)出神經(jīng)保護性效應(yīng)(n=6,p0.05)。即NMDA受體甘氨酸位點全效激動劑以及NR2A亞基的特異性拮抗劑的應(yīng)用均能夠消除GLYX-13對缺血性神經(jīng)元損傷的改善作用。這便進一步證實了GLYX-13是通過作用于NMDA受體的甘氨酸輔助激動位點調(diào)節(jié)NMDA受體的NR2亞基構(gòu)成從而發(fā)揮對缺血性神經(jīng)元損傷的保護性作用。結(jié)論:1、GLYX-13對MCAO模型小鼠具有神經(jīng)保護性。2、GLYX-13通過對NMDA受體NR2亞基的差異性調(diào)節(jié)對腦缺血性神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護性作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743

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本文編號：2302175