【摘要】：神經(jīng)母細胞瘤是兒童最常見的實體腫瘤之一,其惡性程度高、異質(zhì)性高、易對化療產(chǎn)生耐藥性、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)。但自行消退與體外誘導(dǎo)分化成熟的特點,使其成為研究腫瘤分化的較好的模型,闡釋其增殖和分化的機制,能夠為該腫瘤的治療提供新策略。研究者發(fā)現(xiàn)異常的組蛋白甲基化修飾往往引起基因表達活性的改變,從而成為腫瘤發(fā)生的主要誘因之一。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1,主要催化H3K9me3甲基化,在多種類型的腫瘤細胞中高表達,包括非小細胞肺癌,小細胞肺癌,膠質(zhì)瘤和前列腺癌等,下調(diào)其表達會抑制癌細胞的增殖分化以及侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究探究組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖及分化的影響及其機制,揭示了SETDB1及其下游效應(yīng)因子在母瘤增殖和分化過程中的重要作用,以期能為神經(jīng)母細胞瘤的治療提供新思路。以下是本論文主要發(fā)現(xiàn):1.SETDB1參與神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖及分化的調(diào)控我們采用Western blot和熒光定量PCR技術(shù)檢測到SETDB1蛋白在神經(jīng)母細胞瘤細胞系中有普遍表達,接著利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干涉技術(shù)在細胞系BE(2)-C和SHEP1細胞系中對SETDB1的表達進行下調(diào),CCK8實驗檢測結(jié)果顯示SETDB1si細胞的生長受到明顯抑制。軟瓊脂實驗發(fā)現(xiàn)SETDB1si細胞的克隆形成能力明顯下降。同時我們通過建立荷瘤鼠模型,發(fā)現(xiàn)SETDB1si細胞的體內(nèi)成瘤能力降低。最后,我們通過Microarray分析,并采用熒光定量PCR技術(shù),Western blot和細胞免疫熒光實驗檢測了BE(2)-C和SHEP1細胞系的分化情況,發(fā)現(xiàn)SETDB1si細胞向著膠質(zhì)細胞發(fā)生分化。2.setdb1調(diào)控嘌呤代謝途徑的關(guān)鍵酶基因prps1,而prps1也對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖和成瘤有影響我們對setdb1si細胞進行了microarray分析,發(fā)現(xiàn)下調(diào)setdb1影響了細胞的嘌呤代謝相關(guān)途徑。prps1是嘌呤代謝過程中的關(guān)鍵限速酶,我們利用westernblot和熒光定量pcr技術(shù)檢測到在setdb1si的細胞中,prps1的表達也受到了抑制。接著我們對setdb1以及prps1的啟動子進行了染色質(zhì)免疫共沉淀實驗,結(jié)果顯示,setdb1以及h3k9me3均與prps1下游啟動子676-859bp區(qū)域有顯著結(jié)合,表明setdb1能夠調(diào)控prps1基因的轉(zhuǎn)錄,我們推測setdb1可能通過調(diào)控prps1的表達來進一步影響細胞增殖。我們通過分析神經(jīng)母細胞瘤臨床預(yù)后數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)prps1高表達會顯著降低神經(jīng)母細胞瘤患者的生存率,且prps1的表達水平與腫瘤患者的患病年齡、死亡原因、復(fù)發(fā)情況以及n-myc的表達量等相關(guān)。因此我們利用慢病毒介導(dǎo)的shrna干涉技術(shù)在細胞系be(2)-c和shep1細胞系中對prps1進行下調(diào)。首先我們利用westernblot和熒光定量pcr技術(shù)檢測到prps1蛋白在神經(jīng)母細胞瘤細胞系中有普遍表達,然后利用細胞增殖標記brdu進行免疫熒光染色實驗檢測prps1si后細胞的增殖情況,發(fā)現(xiàn)brdu陽性率明顯降低,表明細胞的增殖受到抑制。cck8實驗檢測結(jié)果顯示prps1si后細胞的生長受到明顯抑制。流式細胞儀分析prps1si的細胞周期,發(fā)現(xiàn)細胞周期阻滯于g1期。軟瓊脂實驗發(fā)現(xiàn)prps1si細胞的克隆形成能力顯著降低,細胞的自我更新和增殖活性受到明顯抑制。最后我們通過建立荷瘤鼠模型,發(fā)現(xiàn)prps1si細胞的成瘤能力降低。上述結(jié)果與前述setdb1的實驗結(jié)果說明,setdb1通過調(diào)控prps1表達進而影響神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖和成瘤。3.setdb1調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤原癌基因n-myc的表達為了研究setdb1引起神經(jīng)母細胞瘤細胞分化的機制,我們分析神經(jīng)母細胞瘤臨床預(yù)后數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)setdb1的表達量在有n-myc擴增的患者中顯著高于沒有n-myc擴增的患者。n-myc最先在神經(jīng)母細胞瘤中被證實為原癌基因,它通過影響神經(jīng)母細胞瘤自我更新和分化能力,對神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。我們通過microarray分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)setdb1,包含n-myc在內(nèi)的與神經(jīng)母細胞瘤自我更新能力的相關(guān)基因表達下降,進一步通過熒光定量pcr以及westernblot證實,下調(diào)setdb1顯著的降低了n-myc的表達,說明setdb1的確影響n-myc表達。然后我們在干涉掉setdb1的shep1細胞中過表達n-myc,通過mtt實驗以及brdu標記實驗可以看出,shep1-setdb1si-n-myc細胞的增殖能力得到一定恢復(fù)。最后我們?yōu)榱搜芯縮etdb1與n-myc的調(diào)控關(guān)系,進行了chip-qpcr實驗,結(jié)果顯示setdb1以及h3k9me3均直接與n-myc啟動子上游區(qū)域-2885~-2723bp片段直接結(jié)合,暗示SETDB1直接調(diào)控原癌基因N-MYC,從而影響神經(jīng)母細胞瘤的增殖和分化。綜上所述,SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖、分化以及自我更新能力都具有重要作用;SETDB1的下調(diào)也會顯著抑制嘌呤代謝途徑關(guān)鍵酶基因PRPS1的表達,ChIP-qPCR實驗表明SETDB1能調(diào)控PRPS1的表達,因此我們推測SETDB1可能通過調(diào)控PRPS1來影響核苷酸代謝,進一步影響細胞增殖。而PRPS1在神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖中也具有重要作用;SETDB1與原癌基因N-MYC關(guān)系密切,SETDB1的表達與N-MYC的表達有正相關(guān)性,SETDB1可能直接通過N-MYC參與調(diào)控細胞的增殖分化。本研究結(jié)果為神經(jīng)母細胞瘤的臨床治療神經(jīng)母細胞瘤提供新策略,也豐富了該疾病的理論研究基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.4

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本文編號：2302160