【摘要】：炎癥反應(yīng)在腦缺血-再灌注損傷(CIR)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。膽綠素(BV)在許多疾病發(fā)生發(fā)展過程中能發(fā)揮抗炎作用,但其在CIR病理生理過程中的作用及機(jī)制仍知之甚少。前期研究發(fā)現(xiàn):BV治療大鼠CIR后有腦保護(hù)作用,且缺血側(cè)腦皮質(zhì)炎癥因子釋放減少。高通量二代測(cè)序及高通量技術(shù)為我們?nèi)娣治黾膊“l(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸提供了強(qiáng)有力工具。為探討膽綠素在CIR中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制,我們將大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)miRNAs芯片檢測(cè),mRNA芯片檢測(cè),用qPCR技術(shù)驗(yàn)證芯片篩選結(jié)果,結(jié)合生物信息學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rno-miR-27a-3p及其生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的靶基因Litaf可能參與疾病的發(fā)生,而且沒有在腦缺血中報(bào)道同時(shí)機(jī)制也不明確,有待進(jìn)一步研究。為驗(yàn)證這一假說,我們將通過PC12細(xì)胞株、大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元、大鼠腦缺血-再灌注模型,采用生物信息學(xué),RNA干擾,3'URT熒光素報(bào)告基因,WB,qPCR, Elisa等手段從分子、細(xì)胞水平探討Litaf在CIR中的抗炎作用,研究Litaf在CIR中的作用及其miR-27a的調(diào)控機(jī)制。第一部分膽綠素治療大鼠腦缺血-再灌注損傷后相關(guān)miRNAs的篩選及qPCR定量分析結(jié)果[目的]通過檢測(cè)大鼠正常腦皮質(zhì)組織、缺血側(cè)腦皮質(zhì)、以及經(jīng)膽綠素治療后的缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中microRNAs表達(dá)譜,初步篩選出大鼠缺血大腦皮質(zhì)經(jīng)膽綠素治療后的差異表達(dá)的microRNAs。[方法]采用microRNAs芯片技術(shù)檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中microRNAs的表達(dá)譜,以在缺血后上調(diào)及經(jīng)膽綠素治療后變化趨勢(shì)不同的microRNAs進(jìn)行篩選,以Fold Change≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。并采用qPCR技術(shù)驗(yàn)證候選的microRNAs以進(jìn)行后續(xù)篩選。[結(jié)果]1.與S組相比,C組rno-miR-181b-5p; rno-miR-124-5p; rno-miR-27a-3p; rno-miR-29b-3p 表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0. 05);與C組相比,BV rno-miR-181b-5p;rno-miR-126a-5p;rno-miR-124-5p;rno-miR-27a-3p;rno-m iR-29b-3p表達(dá)量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2. S 組相比,C 組 rno-miR-3072; rno-miR-150-5p; rno-miR-539-3p 表達(dá)量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與C組相比,rno-miR-3072;rno-miR-3573-3p; rno-mmiR-150-5p; rno-miR-935; rno-miR-539-3p 表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)論]1.大鼠正常腦皮質(zhì)組織、缺血側(cè)腦皮質(zhì)、經(jīng)膽綠素治療后的缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中microRNAs表達(dá)譜存在差異;2.共有13個(gè)microRNAs qPCR定量分析結(jié)果趨勢(shì)與microRNAs芯片結(jié)果一致,可能與膽綠素在CIR中發(fā)揮抗炎作用及機(jī)制有關(guān)。第二部分候選microRNAs生物信息學(xué)預(yù)測(cè)[目的]通過對(duì)候選microRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其潛在的靶基因、靶蛋白以及其相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路及GO分析,篩選出可能與膽綠素在CIR中發(fā)揮抗炎作用及機(jī)制有關(guān)microRNAs。[方法]通過上海伯豪生物技術(shù)有限公司生物信息分析小工具;TargetScan數(shù)據(jù)庫;miRmap數(shù)據(jù)庫,將每個(gè)microRNAs在三個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到的靶基因求交集,保留三個(gè)數(shù)據(jù)庫的交集靶基因并運(yùn)用GO分析和Pathway通路富集等生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)到的靶基因潛在的生物學(xué)功能和參與的信號(hào)通路[結(jié)果]候選miRNAs共預(yù)測(cè)到1040個(gè)靶基因進(jìn)行后續(xù)分析。GO分析結(jié)果提示:這些靶基因主要與泛素連接酶,神經(jīng)元突出功能,動(dòng)脈形態(tài)、發(fā)育,記憶,信號(hào)傳導(dǎo)等功能有關(guān);Pathway通路富集分析提示:主要與分析結(jié)果顯示:Rap1,cAMP,MAPK,Fox0, cGMP-PKG,Ras信號(hào)通路,及癌癥相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。[結(jié)論]我們通過miRNA芯片篩選出了可能與膽綠素在CIR中發(fā)揮抗炎作用有關(guān)miRNA表達(dá)譜,同時(shí)靶基因預(yù)測(cè)提示我們一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因,而一個(gè)靶基因又可能同時(shí)受多個(gè)miRNA的調(diào)控,可見mmiRNA的調(diào)控機(jī)理是十分復(fù)雜的。生物信息學(xué)分析提示差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)到的靶基因廣泛參與多個(gè)生物學(xué)過程,我們可以推測(cè)這些異常表達(dá)的miRNA可能通過調(diào)控特定功能的靶基因,參與重要信號(hào)傳導(dǎo)通路,在膽綠素在CIR中發(fā)揮抗炎作用中發(fā)揮重要角色。后期需要進(jìn)一步研究以認(rèn)識(shí)這些差異miRNA參與膽綠素在CIR中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。第三部分膽綠素治療大鼠腦缺血-再灌注后相關(guān)mRNAs的篩選及qPCR定量分析結(jié)果[目的]通過檢測(cè)大鼠正常腦皮質(zhì)組織、缺血側(cè)腦皮質(zhì)、以及經(jīng)膽綠素治療后的缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織mRNA差異表達(dá)譜,初步篩選出大鼠缺血大腦皮質(zhì)經(jīng)膽綠素治療后的差異表達(dá)的mRNA。結(jié)合篩選出的候選microRNAS做“miRNA-靶蛋白”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)學(xué)說分析,篩選出可能參與膽綠素在CIR中發(fā)揮抗炎作用的“miRNA-靶蛋白”。[方法]采用mRNA芯片技術(shù)檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中mRNA的表達(dá)譜,以在缺血后上調(diào)及經(jīng)膽綠素治療后變化趨勢(shì)不同的microRNAs進(jìn)行篩選,以Fold Change≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。將滿足條件的芯片差異表達(dá)mRNA與候選microRNAs靶基因取交集后,保留交集靶基因做后續(xù)篩選。將交集靶基因上Pubmed網(wǎng)站檢索交集靶基因在缺血缺氧疾病中的報(bào)道情況,篩選出可能和改疾病有關(guān)的基因,進(jìn)行qPCR定量分析。根據(jù)mRNA qPCR定量分析結(jié)果結(jié)合之前的microRNAs芯片分析結(jié)果篩選出符合“miRNA-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控學(xué)說的靶蛋白進(jìn)行后續(xù)功能驗(yàn)證。[結(jié)果]1.將滿足條件的芯片差異表達(dá)mRNA與候選microRNAs靶基因取交集后,共有49個(gè)交集靶基因。2.篩選出33個(gè)可能與該疾病過程有關(guān)的,且新穎的基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。3.與 S 組比較,C 組 Sox7; Fbxo33; Ets1; Gcnt2; Csrnp1; En2; Rgs1; Litaf;Rnd3; Zc3h12d; P4hb; Mthfd2; Mafk; B4galt1; Slc25a25; Esm1; Vps37c;Zmiz1; Rhoq; Tagln2; Plp2; Zkscan1; Guca1b; Pnrc1;的 mRNA 表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與C組比較,BV組Sox7; Fbxo33;Ets1; Gcnt2; Csrnp1; En2; Rgs1; Litaf; Rnd3; Zc3h12d; P4hb; Mthfd2;Mafk; B4galt1; Slc25a25; Esm1; Vps37c; Zmiz1; Rhoq; Tagln2; Plp2;Zkscan1; Guca1b; Pnrc1的mRNA表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.與S組比較,C組Map2k6; Scn4b的mRNA表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與C組比較,BV組Map2k6表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5.經(jīng)查詢各候選基因的報(bào)道及功能情況,推測(cè)rno-miR-27a-3p和其靶基因Litaf可能與膽綠素治療CIR過程中,抑制炎癥因子釋放有關(guān)。且qPCR驗(yàn)證結(jié)果提示二者變化趨勢(shì),符合“miRNA-靶蛋白”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控學(xué)說。[結(jié)論]1.大鼠正常腦皮質(zhì)組織、缺血側(cè)腦皮質(zhì)、經(jīng)膽綠素治療后的缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中mRNA表達(dá)譜存在差異;2.共有26個(gè)mRNA qPCR定量分析結(jié)果趨勢(shì),符合“miRNA-靶蛋白”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)學(xué)說,可能與膽綠素在CIR中發(fā)揮抗炎作用及機(jī)制有關(guān)。3.推測(cè)rno-miR-27a-3p和其靶基因Litaf可能與膽綠素治療CIR過程中,抑制炎癥因子釋放有關(guān)。第四部分Litaf對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪-復(fù)糖復(fù)氧后TNF-α釋放的影響[目的]探索Litaf及miR27a在是否通過抑制炎癥因子TNF- α釋放,在膽綠素治療CIR中通過抗炎發(fā)揮保護(hù)作用。[方法]通過PC12細(xì)胞株、大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元、SiRNA干擾,3'URT熒光素報(bào)告基因,WB,qPCR,Elisa等手段從分子、細(xì)胞探討miR27a在CIR中的重要作用,研究Litaf在CIR中的作用及其miR-27a的調(diào)控機(jī)制。[結(jié)果]1. 2ug/ml膽綠素處理可以提高細(xì)胞OGD/R后的細(xì)胞活力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2. OGD/R后Litaf表達(dá)水平明顯升高,膽綠素治療后Litaf表達(dá)水平明顯降低;miR-27a變化趨勢(shì)與Litaf變化趨勢(shì)相反。3.與組1相比,組2 Litaf、TNF-α表達(dá)量明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);與組2相比,組6 Litaf、TNF-α表達(dá)量明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。4.與組1相比,組2 Litaf、TNF-α表達(dá)量明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);與組2相比,組3 Litaf、TNF-α表達(dá)量明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。5.與組1相比,組2 Litaf、TNF-α表達(dá)量明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);與組2相比,組6 Litaf、TNF-α表達(dá)量明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0. 01);組6相比,組7 Litaf表達(dá)量明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。6.除組6外,miR-27a變化趨勢(shì)與Litaf相反,組6與組7、8、9相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。[結(jié)論]1.膽綠素處理可以提高細(xì)胞OGD/R后的細(xì)胞活力。2.膽綠素、及Litaf SiRNA在體外可以明顯抑制皮質(zhì)神經(jīng)元OGD/R后TNF-α釋放。3. MiR-27a可能調(diào)控Litaf表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2281319