【摘要】：研究背景及目的:卒中是危害健康的全球性重要疾病,在美國,其致死和致殘率仍排在第四位,幸存的卒中患者中,大多數(shù)存在中至重度殘疾,導(dǎo)致上千億美元的損失。腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)占所有中風(fēng)的10 15%,死亡率可以高達(dá)30-50%,74%的幸存者發(fā)病后12個(gè)月仍然存在功能依賴,但對于這樣一種嚴(yán)重的疾病,目前尚沒有有效的治療策略,血腫清除治療只能在超急性期,出血量較大的患者進(jìn)行干預(yù),受益的只有一小部分病人,而血腫周圍水腫(perihematomal edema,PHE)的發(fā)展和對腦組織的繼發(fā)損傷的治療仍顯得蒼白無力。血腫引起的原發(fā)性損傷包括大腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物理破壞和占位效應(yīng)的影響。占位效應(yīng)引起顱內(nèi)壓力增高,進(jìn)而引發(fā)腦血流下降甚至腦疝形成,導(dǎo)致血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)破壞,水腫形成,神經(jīng)損傷。隨后,隨著出血性成分的釋放,腦源性神經(jīng)損傷的信號,對凝血和補(bǔ)體系統(tǒng)觸發(fā)激活腦內(nèi)炎癥形成導(dǎo)致的繼發(fā)性腦損傷。首先是小膠質(zhì)細(xì)胞激活,其次是中性粒細(xì)胞,然后是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,通過釋放活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),炎性介質(zhì),和直接的細(xì)胞毒作用從而加劇血腫周圍腦損傷。對BBB的破壞,促進(jìn)白細(xì)胞的浸潤,本身可引起炎癥。作為一個(gè)結(jié)果,這有助于ICH后炎癥級聯(lián)反應(yīng)和PHE的形成,加劇了占位效應(yīng)的影響,并加速了細(xì)胞的死亡過程。在ICH后的第一個(gè)24小時(shí)后,PHE增加75%左右,峰值在5至6天,并持續(xù)到14天。PHE的程度被視為ICH結(jié)局的重要預(yù)測指標(biāo)。在初步研究中,免疫調(diào)節(jié)劑可以減少PHE的進(jìn)展,在血漿中降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)水平和改善ICH患者的臨床結(jié)果。感染是中風(fēng)后的一個(gè)重要的臨床并發(fā)癥,增加殘疾率和死亡率。盡管考慮較差的Glasgowcoma量表(Glasgowcoma scale,GCS)評分、插管、吞咽困難、侵入性操作可能與此相關(guān),ICH后感染的機(jī)制尚不清楚。在動物模型的研究中顯示,ICH似乎損害外周細(xì)胞免疫。盡管有上述背景,ICH對免疫系統(tǒng)的影響,潛在的機(jī)制及其與患者預(yù)后的關(guān)系仍不清楚。因此,我們試圖探討ICH患者出血后免疫系統(tǒng)器官和細(xì)胞水平的改變,并確定引起這種變化的神經(jīng)通路。使免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有可能成為治療新的靶點(diǎn)。脾是機(jī)體最大的次級免疫器官,其體積變化是其功能以及整個(gè)機(jī)體免疫環(huán)境改變的重要信號,不同免疫細(xì)胞群體在ICH后的變化是了解外周免疫變化的重要途徑,目前對于運(yùn)用磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)的不同序列來了解ICH后脾體積及功能變化的研究未見報(bào)道,通過對ICH患者脾臟和外周血免疫細(xì)胞變化的研究,了解ICH后外周免疫狀態(tài)的研究亦未見報(bào)道,我們的研究期望為ICH后免疫功能變化提供直接證據(jù),為ICH后免疫系統(tǒng)機(jī)制的研究鋪墊道路,以期對ICH后開發(fā)有效的免疫調(diào)節(jié)治療提供理論依據(jù)。研究方法:1.ICH的參與者:選取≥18歲男性和非妊娠女性原發(fā)性基底節(jié)區(qū)出血的患者35例,出血量5-40ml經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(head computed tomographic,CT)證實(shí),發(fā)病后24小時(shí)以內(nèi)入院,GCS評分≥6分。排除GCS評分3~5分的患者,具有外科手術(shù)指征的患者,住院前2周內(nèi)有感染的患者,也排除了血腫擴(kuò)大,繼發(fā)性ICH患者,同時(shí)使用抗腫瘤,免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)治療的患者。20例健康對照組按年齡、性別和體重指數(shù)相匹配。2.頭和脾臟MRI檢查:所有患者于癥狀發(fā)作后第3天和第14天行頭部和脾臟MRI檢查,頭部MRI進(jìn)行軸位T2/T1/FLAIR/DWI掃描,明確出血位置及評估出血量及PHE情況。脾臟軸位T2掃描序列測量脾臟體積,多B值DWI掃描測量脾臟D值、D*值。正常對照組進(jìn)行脾臟軸位T2掃描測量脾臟體積,多B值DWI掃描測量脾臟D值、D*值。出血體積和PHE是由大腦FLAIR序列圖像量化。研究方案經(jīng)天津市第三中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。并獲得每個(gè)患者的知情同意。3.外周血循環(huán)中淋巴細(xì)胞及其亞群檢測:所有受試者和健康對照組均進(jìn)行了新鮮全血淋巴細(xì)胞及其亞群分析。分離單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記抗體的免疫染色。熒光標(biāo)記抗體包括:CD3-PerCP,CD4-FITC,CD8-PE,CD19-PE,CD56-APC,CD11b-PerCP,CD11c-APC。數(shù)據(jù)通過應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)提取,然后應(yīng)用Flowjo 7.6.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。4.神經(jīng)遞質(zhì)和激素的測定:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)并按制造商的說明書對血漿中的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和去甲腎上腺素和糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇進(jìn)行測定。在450納米和570納米進(jìn)行光學(xué)密度測定。5.建立實(shí)驗(yàn)性ICH小鼠模型:成年雄性C57BL/6小鼠(10~12周齡)被用于動物實(shí)驗(yàn)。對膠原酶誘導(dǎo)ICH模型,在小鼠腦內(nèi)右側(cè)基底節(jié)部位,注射膠原酶。為在體內(nèi)誘導(dǎo)不同體積的ICH量,使用不同劑量的膠原酶。對于自體血注射的小鼠模型,利用30μl自體血注射在小鼠腦內(nèi)右側(cè)基底節(jié)區(qū)。6.ICH小鼠檢測指標(biāo):在不同時(shí)間點(diǎn)處死后立即脾臟稱重,并進(jìn)行病理染色。0.0375u膠原酶注射誘導(dǎo)小鼠模型建立3天后處死;快速移出脾臟并于4%多聚甲醛固定后,用30%蔗糖脫水直到組織沉淀在底部。在最佳切削溫度復(fù)合孵化,制成8μm厚的組織切片,每個(gè)組織切片進(jìn)行HE染色,測量脾臟的白髓與紅髓區(qū)面積,圖片由熒光顯微鏡獲得,應(yīng)用Pro Plus圖片處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。7.小鼠的神經(jīng)通路阻斷實(shí)驗(yàn):阻滯劑包括:RU486溶解在乙醇(1:10,6 mg/ml),造模成功后以30 mg/kg的劑量腹腔注射,普萘洛爾溶解在生理鹽水配制成6 mg/ml的溶液,造模成功后以60 mg/kg的劑量腹腔注射,二氫-β-刺桐定(DHβE)溶解在生理鹽水配制成0.1 mg/ml的溶液,造模成功后以1mg/kg的劑量腹腔注射。根據(jù)不同的阻斷記錄脾臟收縮的情況。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17版軟件進(jìn)行(SPSS,公司,芝加哥,IL,美國)。計(jì)量資料的結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料的結(jié)果用率表示。計(jì)量資料兩組間的比較,符合參數(shù)檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)使用t檢驗(yàn),否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法(Mann-Whitney檢驗(yàn))。計(jì)量資料三組及三組以上間的比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩組間重復(fù)測量數(shù)據(jù)的比較采用雙因素方差分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)。脾的變化和淋巴細(xì)胞數(shù)的之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:1.入院時(shí)ICH患者的特點(diǎn):本研究共納入從2015八月至2016五月35例ICH患者。沒有死亡病例,沒有脫落和失訪病例。從發(fā)病到入院的平均時(shí)間為11.7±8.5小時(shí)。入選患者的平均年齡為62.1±11.8歲,男:女比例為27:8。20例健康對照組平均年齡59.1±9.8歲,男:女比例為15:5。ICH和健康對照組的年齡、性別和體重指數(shù)(BMI)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.ICH后出現(xiàn)脾臟收縮,脾臟毛細(xì)血管灌注增加,脾臟細(xì)胞組織活性無改變:ICH患者的脾臟體積在發(fā)病后3天均小于發(fā)病后14天;事實(shí)上在14天,其脾臟體積與對照組的大小類似。在我們的研究中,脾體積在第3天和第14天相比,平均收縮了37cm3,,平均減少17.2%。磁共振體素內(nèi)非相干性運(yùn)動-彌散加權(quán)成像(Intravoxel incoherent motiondiffusion-weighted imaging,IVIM-DWI)MRI檢測序列中,患者第3天的D*值顯著高于第14天(P0.001),第14天的D*值與健康對照組比較其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�；颊叩�3天的D值與第14天相比較是穩(wěn)定的,而且與健康對照組相比較其差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.脾臟收縮可以由入院時(shí)血腫大小預(yù)測,并與PHE和ICH預(yù)后相關(guān):將ICH患者分為兩組:重度脾收縮37cm3(n=16)組或輕度脾收縮37cm3(n=19)組。在重度脾收縮組患者入院的平均出血量大于輕度脾收縮組患者的出血量(12.9±10.5 vs 8.2±6.5毫升,P0.05)。此外,我們發(fā)現(xiàn)在入院時(shí)出血量(小于24小時(shí))與ICH 3天后脾臟收縮呈正相關(guān)(r=0.48,P0.01)。輕度脾收縮組患者在ICH后最初的3天PHE迅速擴(kuò)大,這種趨勢持續(xù)至14天。與此相反,嚴(yán)重脾收縮組患者在ICH后最初的3天PHE進(jìn)展溫和,且水平在隨后的11天基本上保持不變。定量分析,嚴(yán)重脾收縮組患者與輕度脾收縮組患者相比,在ICH后的3天和14天相對PHE(relative PHE,rPHE),嚴(yán)重脾收縮組患者比輕度脾收縮組患者較小(2.8±1.5 vs 4.5±1.5,P0.001;3.2±1.5vs 5.8±2.5,P0.01)。嚴(yán)重脾收縮組患者與輕度脾收縮組患者相比,從入院到90天NIHSS評分兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在從入院到90天患者的NIHSS評分下降的分?jǐn)?shù)嚴(yán)重脾收縮組患者比輕度脾收縮組患者多(P0.05)。然而,改良Rankin量表(Rankin Scale,MRS)0 1分的患者在90天兩組之間沒有達(dá)到顯著性差異。4.ICH后T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)的細(xì)胞缺陷,與ICH后感染的增加和不良結(jié)局的易感性相關(guān):淋巴細(xì)胞和CD4+T、NK、B細(xì)胞,和CD11c+細(xì)胞在ICH發(fā)病后減少。除了一個(gè)亞群,這些細(xì)胞在ICH后3天達(dá)到最低點(diǎn),并持續(xù)在低水平直到14天。雖然CD8+T細(xì)胞亞群在ICH后顯示出同樣的負(fù)面趨勢,但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞在ICH后3天的計(jì)數(shù)入院時(shí)血腫體積呈負(fù)相關(guān)(圖3B),但總淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞亞群沒有顯示這種關(guān)聯(lián)。ICH患者無論是淋巴細(xì)胞全細(xì)胞譜還是亞群細(xì)胞數(shù)在脾臟收縮37cm3和脾臟收縮37cm3的兩組患者間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在這35名受試者中,有12人(34%)在住院期間遭受感染,入院時(shí),繼發(fā)感染患者的血腫大小似乎大于非感染患者;然而,這種差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.5±9.5 vs 8.7±6.7 cm3,P0.05)。無感染的患者中,70%的患者有較好的預(yù)后,被感染的患者只有8%有較好的預(yù)后,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0001)。此外,CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞計(jì)數(shù)感染患者組比沒有感染患者組顯著降低,從第1天到第14天。5.實(shí)驗(yàn)性ICH小鼠模型中,下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的激活和交感神經(jīng)的協(xié)同作用可能介導(dǎo)了ICH后的脾臟反應(yīng):在兩種ICH實(shí)驗(yàn)性小鼠的模型中,均出現(xiàn)了顯著的脾臟縮小的變化,與ICH患者的臨床結(jié)果相一致。ICH后的脾臟收縮與不同的血腫體積呈正相關(guān)。HE染色觀察小鼠脾臟變化,發(fā)現(xiàn)ICH后脾臟毛細(xì)血管的灌注增加,小鼠白髓區(qū)減少,(P0.05)。我們用β-腎上腺素能受體阻滯劑,普萘洛爾,對腎上腺素能阻滯,糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486,α4β2膽堿能阻滯劑DHβE對膽堿能阻斷。我們的研究結(jié)果表明,DHβE未能抑制脾收縮,但普萘洛爾和RU486可部分抑制ICH小鼠的脾臟收縮。此外,神經(jīng)遞質(zhì)檢測表明,ICH患者較健康對照組血漿中的乙酰膽堿水平較低,從第3天到第14天,并保持穩(wěn)定,從第3天和14天在ICH患者血清中去甲腎上腺素和皮質(zhì)醇的濃度較高。結(jié)論:1.腦出血后3天,脾臟體積減少、脾的毛細(xì)血管血流灌注增加,但不伴有脾細(xì)胞活性變化。2.脾體積的減少程度與入院時(shí)血腫體積的大小呈正相關(guān)關(guān)系,與PHE進(jìn)展相關(guān),與神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)相關(guān)。3.ICH后患者免疫細(xì)胞的功能缺陷和感染易感性增加以及不良結(jié)局的發(fā)生相關(guān)。4.下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的激活和交感神經(jīng)的協(xié)同作用可能介導(dǎo)了ICH后的脾臟反應(yīng)。5.脾萎縮和淋巴細(xì)胞減少,反映出ICH后在器官和細(xì)胞水平對免疫系統(tǒng)的影響的兩個(gè)方面,源自交感神經(jīng)和HPA軸的協(xié)同作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.34
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4 周[瑂，
本文編號：2277882
