【摘要】：癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)目前約有900多萬(wàn)癲癇患者，其中25％-40％為難治性癲癇，顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是最常見的難治性癲癇類型，主要特點(diǎn)是逐漸進(jìn)展的原發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作（spontaneous recurrent epileptic seizure，SRS）和海馬硬化，伴有明顯的藥物抵抗性。臨床調(diào)查表明，超過(guò)一半的癲癇患者具有不同程度的認(rèn)知功能障礙，有的因癲癇發(fā)作頻繁不能堅(jiān)持服藥，有的因長(zhǎng)期服用抗癲癇藥物（藥物本身可致不同程度的認(rèn)知功能障礙）所致，這無(wú)疑給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。 匹魯卡品（pilocarpine，PILO）致癇大鼠的行為學(xué)、海馬神經(jīng)元損傷的病理形態(tài)學(xué)及神經(jīng)電生理學(xué)等改變均與人類的TLE相似，因此該模型是目前研究癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）和TLE的經(jīng)典模型之一。 SE的致病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明，主要包括：苔蘚纖維芽生假說(shuō)；Ca2+內(nèi)流引發(fā)的細(xì)胞毒性；谷氨酸和γ-氨基丁酸及其受體結(jié)構(gòu)和功能異常；氧化應(yīng)激損傷及凋亡等。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增多或體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，體內(nèi)氧自由基代謝就會(huì)失衡，蓄積過(guò)多的ROS易導(dǎo)致組織受損。ROS通過(guò)直接或間接氧化損傷DNA、誘發(fā)基因突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過(guò)氧化，激活非選擇性鈣通道，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。另外，SE時(shí)常伴嚴(yán)重的缺氧，易致ROS的增加，而ROS也可直接或間接堆積于線粒體，損傷線粒體膜，降低膜電位，造成線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常，使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C（Cytochrome c）釋放入細(xì)胞質(zhì)，引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，對(duì)如何減少氧化應(yīng)激ROS的產(chǎn)生、保護(hù)線粒體并抑制細(xì)胞凋亡具有重要的研究意義，探索難治性癲癇的替代治療或輔助治療措施便成為當(dāng)務(wù)之急。 目前已發(fā)現(xiàn)多種預(yù)處理方法可以誘導(dǎo)組織細(xì)胞對(duì)缺氧產(chǎn)生耐受，包括缺血、高壓氧、高溫、低溫、睡眠剝奪等，這些方法由于本身存在明顯的副作用，在臨床實(shí)際應(yīng)用方面受到限制。眾所周知，低氧容易改變機(jī)體的生理功能，嚴(yán)重的低氧往往引起的是一種損傷的病理改變，而最近研究發(fā)現(xiàn)適度的低氧預(yù)處理對(duì)機(jī)體則起到一定的保護(hù)效應(yīng)。 研究已證實(shí)，低氧預(yù)處理可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子α、上調(diào)促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及Bcl-2抗凋亡蛋白等在海馬CA1和CA3區(qū)的表達(dá)，改善腦缺血缺氧后腦組織的損傷及其導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。越來(lái)越多的研究報(bào)道，慢性間歇性低壓低氧（chronic intermittent hypobarichypoxia，CIHH）對(duì)機(jī)體多種組織、器官均有明顯的保護(hù)作用，例如增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺血缺氧的耐受性，對(duì)抗缺血/再灌注所致的心臟功能損傷、抑制心肌超微結(jié)構(gòu)受損及鈣離子超載、保持鈣穩(wěn)態(tài)，并能夠有效抗心律失常，保護(hù)神經(jīng)、肝臟、腎臟等組織器官；而且CIHH還具有降壓、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、增強(qiáng)免疫功能等作用。在缺血性腦血管病方面的研究中，CIHH通過(guò)上調(diào)大鼠腦內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（glutamate transporter-1，GLT-1）誘導(dǎo)其產(chǎn)生缺氧耐受性。而CIHH預(yù)處理是否對(duì)癲癇也具有一定的腦保護(hù)作用？目前尚未見報(bào)道。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)的SE大鼠模型，觀察CIHH對(duì)致癇大鼠的行為學(xué)、腦組織形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等方面的影響，評(píng)價(jià)CIHH預(yù)處理的保護(hù)作用并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制，為此主要致力于以下四個(gè)部分的研究： 第一部分CIHH預(yù)處理對(duì)匹魯卡品致癇大鼠的腦保護(hù)效應(yīng) 目的：建立匹魯卡品（pilocarpine，PILO）誘導(dǎo)的SE大鼠模型，研究CIHH預(yù)處理對(duì)PILO致癇大鼠的腦損傷是否具有保護(hù)作用，分別從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，并初步探討其作用機(jī)制。 方法： （實(shí)驗(yàn)一）將成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組（CON組）和PILO模型組（SE組），根據(jù)SE發(fā)作后不同的時(shí)間點(diǎn)分為SE3h、SE12h、SE24h、SE72h和SE7d五個(gè)亞組，每組各10只。應(yīng)用Nissl染色法和流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)觀察SE后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡情況，檢測(cè)該模型制備是否成功。 （實(shí)驗(yàn)二）根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道：SE后腦組織損傷程度最嚴(yán)重的時(shí)間多為發(fā)作后72h，我們選取SE72h進(jìn)行研究，將動(dòng)物隨機(jī)分為4組：CON組（n=7），SE組（n=13），CIHH+SE組（n=13），CIHH組（n=7）。利用腦電圖觀察大鼠的癇性發(fā)作潛伏期和癲癇波發(fā)放的頻率，并記錄死亡率；對(duì)腦組織一部分行Nissl染色計(jì)數(shù)海馬組織中存活的神經(jīng)元；另一部分應(yīng)用流式細(xì)胞儀定量分析海馬神經(jīng)元的凋亡情況。 結(jié)果： （實(shí)驗(yàn)一） 150只大鼠中，41只被誘發(fā)SE，成功率為82％，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共死亡9只（包括誘發(fā)SE成功后的7只），最終可納入實(shí)驗(yàn)的大鼠共34只。CON組無(wú)大鼠死亡，10只均可納入實(shí)驗(yàn)。 2Nissl染色：CON組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，無(wú)神經(jīng)元丟失；SE3h組和SE12h組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，未見到明顯的神經(jīng)元丟失；SE24h組可見大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元部分丟失；SE72h組神經(jīng)元丟失明顯，且CA1區(qū)更嚴(yán)重。而SE7d組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失較SE72h組有所減少。 與CON組相比，SE3h組、SE12h組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量幾乎無(wú)減少（P0.05）；SE24h組、SE72h組和SE7d組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少（P0.05）。與SE72h組相比，其它組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯增加（P0.05）。 3細(xì)胞凋亡率：與CON組相比，SE3h組、SE12h組的海馬細(xì)胞凋亡率均無(wú)明顯增加（P0.05），而SE24h組、SE72h組和SE7d的細(xì)胞凋亡率有不同程度的增加（P0.05）。與SE72h組相比，SE24h組和SE7d組海馬細(xì)胞的凋亡率均有所下降（P0.05），但后兩者間無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。與Nissl染色及以往的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，證明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽涫浅晒Φ�、可行的�?(實(shí)驗(yàn)二) 1SE組、CIHH+SE組大鼠的死亡率分別為23.1%和0%。與SE組相比，CIHH+SE組的潛伏期延長(zhǎng)（33.9±2.3min vs.24.5±1.7min，P0.05）；癲癇波發(fā)放的頻率更少（100.5±2.9HZ vs.118.3±4.0HZ，P0.05）。CON組和CIHH預(yù)處理組中大鼠均無(wú)SE發(fā)作及死亡。 2Nissl染色：CON組大鼠的海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，幾乎無(wú)神經(jīng)元丟失。與CON組相比，SE組大鼠神經(jīng)元丟失明顯；CIHH+SE組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)部分完整，尼氏小體數(shù)量較SE組顯著增加。CIHH組大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，偶見神經(jīng)元丟失。 海馬神經(jīng)元存活數(shù)：與CON組相比，SE組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少（P0.05）；經(jīng)CIHH預(yù)處理后明顯增加了神經(jīng)元的存活數(shù)量（P0.05）。單純行CIHH預(yù)處理組存活的神經(jīng)元數(shù)量雖然少于CON組，但兩者間無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 3細(xì)胞凋亡率：與CON組相比，SE組和CIHH+SE組的海馬細(xì)胞凋亡率均明顯增加（P0.05）；單純行CIHH組細(xì)胞凋亡率雖然稍高于CON組，，但兩者無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。與SE組相比，CIHH+SE組的細(xì)胞凋亡率明顯減低（P0.05）。 結(jié)論：PILO誘導(dǎo)的SE大鼠模型能較好的動(dòng)態(tài)觀察腦損傷后神經(jīng)元凋亡情況。SE發(fā)作后72h時(shí)，海馬組織CA1區(qū)損傷最為嚴(yán)重；CIHH預(yù)處理可能通過(guò)延長(zhǎng)SE大鼠的腦電圖癇性放電潛伏期、降低癇性波發(fā)放頻率來(lái)抑制癲癇發(fā)作，降低海馬神經(jīng)元的凋亡率。第二部分不同的低氧預(yù)處理對(duì)匹魯卡品致癇大鼠的海馬損傷作用 目的：已有研究表明，慢性間歇性常壓低氧（chronic intermittentnormobaric hypoxia，CINH）對(duì)大鼠的腦組織損傷發(fā)揮著一定的保護(hù)作用。本研究分別從PILO誘導(dǎo)的SE大鼠的SRS、胞漿內(nèi)鈣離子濃度及細(xì)胞凋亡率等方面比較兩種不同的預(yù)處理方式（CIHH和CINH）對(duì)大鼠海馬損傷的保護(hù)作用。 方法：將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（CON組，n=18），PILO模型組（SE組，n=34），CIHH預(yù)處理+SE組（CIHH-Pre組，n=24）和CINH預(yù)處理+SE組（CINH-Pre組，n=24）。將每組大鼠分為兩部分：一部分應(yīng)用視頻腦電圖(V-EEG)觀察大鼠SE后自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作（SRS）情況（包括SRS的頻率、發(fā)作級(jí)別及持續(xù)時(shí)間）；另一部分于SE72h時(shí)分別應(yīng)用Nissl和FJB染色法觀察大鼠海馬的神經(jīng)元凋亡和變性情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)海馬胞漿內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i）和細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： 1PILO誘導(dǎo)的SE大鼠死亡率為47.1%，而CIHH-Pre組和CINH-Pre組SE大鼠的死亡率分別為16.7%和20.8%。 V-EEG記錄SRS的情況：CIHH-Pre組和CINH-Pre組出現(xiàn)SRS的頻率、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間均較SE組明顯降低（P0.05）。與CINH-Pre組相比，CIHH-Pre組出現(xiàn)SRS的頻率更少（P0.05），發(fā)作級(jí)別更低（P0.05）。CON組大鼠無(wú)SRS發(fā)作和死亡。 2與CON組相比，SE組海馬胞漿內(nèi)[Ca2+]i明顯升高（2.16±0.06vs.1.19±0.03，P0.05）。與SE組相比，CIHH-Pre組大鼠海馬胞漿內(nèi)[Ca2+]i（1.51±0.03）和CINH-Pre組（1.74±0.03）均明顯的降低（P0.05）；且CIHH-Pre組海馬胞漿內(nèi)[Ca2+]i低于CINH-Pre組（P0.05）。 3與CON組相比，SE組大鼠海馬的神經(jīng)元丟失明顯；而CIHH-Pre組和CINH-Pre組神經(jīng)元丟失的程度較SE組減輕。SE組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)量均較CON組明顯減少（P0.05）。與SE組相比，CIHH-Pre組和CINH-Pre組均明顯地增加了大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量（P0.05）；而CINH-Pre組CA1區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)量仍低于CIHH-Pre組（55.00±1.07vs.74.83±1.40，P0.05）。 4CON組未見明顯的FJB陽(yáng)性細(xì)胞。與CON組相比，PILO誘導(dǎo)的SE組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)可見呈黃綠色熒光的FJB陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。CIHH-Pre組和CINH-Pre組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)均明顯減少了FJB陽(yáng)性細(xì)胞（P0.05）,且CIHH-Pre組CA1區(qū)的FJB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于CINH-Pre組（P0.05）。 5PILO誘導(dǎo)的SE組大鼠海馬細(xì)胞早期凋亡率（Q4）和總的凋亡率（Q2+Q4）均明顯高于CON組（P0.05）。與SE組相比，CIHH-Pre組和CINH-Pre組均明顯地降低了海馬細(xì)胞的凋亡率（P0.05），且CIHH-Pre組的凋亡率低于CINH-Pre組（P0.05）。 結(jié)論：PILO誘導(dǎo)的SE大鼠容易出現(xiàn)SRS行為，使海馬組織細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i升高，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。CIHH和CINH預(yù)處理均可通過(guò)有效地抑制SE大鼠的SRS行為和胞漿內(nèi)鈣離子超載來(lái)營(yíng)救損傷的海馬神經(jīng)元，且CIHH預(yù)處理措施可能更有效。 第三部分CIHH對(duì)匹魯卡品致癇大鼠的海馬抗氧化防御體系的影響 目的：研究CIHH預(yù)處理是否對(duì)癲癇發(fā)作產(chǎn)生的氧化應(yīng)激及線粒體損傷具有一定的保護(hù)作用，并探討可能的作用機(jī)制。 方法：將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（CON組），PILO模型組（SE組）和CIHH預(yù)處理+SE組（CIHH+SE組），每組各20只。于SE發(fā)作后72h時(shí)，首先制作大鼠海馬組織的勻漿液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)MDA含量、總SOD、SOD1、SOD2及GSH的活力；然后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)海馬組織細(xì)胞內(nèi)ROS、線粒體膜電位（mitochondrial transmembranepotential，△Ψm）的水平；Western Blot檢測(cè)胞漿中Cytochrome c、Caspase3、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)；并結(jié)合透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1與CON組相比，SE組大鼠海馬內(nèi)MDA的水平明顯升高（P0.05）；總的SOD和SOD2的活力均明顯降低（P0.05），GSH的含量也明顯降低（P0.05），而CIHH+SE組可不同程度地逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的異常改變（P0.05）。SODl在各實(shí)驗(yàn)組間則無(wú)明顯差異（P0.05）。 2與SE組相比， CIHH+SE組能明顯降低海馬細(xì)胞內(nèi)ROS的水平（P0.05），明顯升高△Ψ的水平（P0.05）。 3與CON組相比，SE組大鼠海馬組織胞漿內(nèi)Cytochrome c，Caspase3，Bax，及Bax/Bcl-2蛋白的水平均明顯升高（P0.05），而Bcl-2蛋白水平顯著降低（P0.05）。CIHH預(yù)處理后均可不同程度地逆轉(zhuǎn)上述蛋白的表達(dá)水平（P0.05）。 4與CON組相比，SE組中線粒體的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為廣泛的空泡化、嚴(yán)重的嵴斷裂伴膜破壞；而CIHH+SE組可部分改善線粒體的結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)論：SE發(fā)作后線粒體可能是自由基攻擊的靶點(diǎn)。CIHH預(yù)處理可通過(guò)增強(qiáng)大鼠海馬組織的抗氧化應(yīng)激能力，改善線粒體的結(jié)構(gòu)和功能來(lái)發(fā)揮神經(jīng)元的保護(hù)作用。第四部分CIHH對(duì)匹魯卡品致癇大鼠認(rèn)知功能的改善作用和機(jī)制探討 目的：研究CIHH預(yù)處理對(duì)SE大鼠的認(rèn)知功能障礙、海馬組織中突觸的超微結(jié)構(gòu)和突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)有何影響，進(jìn)一步探討相關(guān)的作用機(jī)制。 方法：將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（CON組，n=10）和PILO模型組（SE組，n=20）和CIHH預(yù)處理+SE組（CIHH+SE組，n=20）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：SE發(fā)作后多于14-42d出現(xiàn)SRS行為，由此我們選取SE發(fā)作后42d時(shí)，進(jìn)行Morris水迷宮行認(rèn)知功能檢測(cè)；結(jié)束后分別應(yīng)用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)突觸的超微結(jié)構(gòu)；WesternBlot法檢測(cè)胞漿中PSD-95和Kalirin-7蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：由于大鼠經(jīng)SE發(fā)作后部分出現(xiàn)死亡，本部分實(shí)驗(yàn)中SE發(fā)作后42d時(shí)，各組大鼠的存活情況：CON組10只，PILO誘導(dǎo)的SE組9只，CIHH+SE組14只。 1水迷宮檢測(cè)：隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，從第3d開始，各組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期均逐漸縮短（P0.05）。CIHH預(yù)處理組較SE組的潛伏期明顯縮短（P0.05）。在空間探索試驗(yàn)中，與CON組相比，SE組大鼠的穿臺(tái)次數(shù)明顯減低（5.33±0.58vs.11.8±0.76，P0.05），在目標(biāo)象限停留時(shí)間也明顯縮短（52.78±2.00s vs.86.80±1.67s，P0.05）；而CIHH+SE組大鼠的穿臺(tái)次數(shù)（7.86±0.44）較SE組有所增加（P0.05），在目標(biāo)象限停留時(shí)間（67.36±2.06s）也明顯延長(zhǎng)（P0.05）。在可視平臺(tái)試驗(yàn)中，各組間大鼠的逃避潛伏期和游泳速度均無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 2突觸間隙寬度:與CON組相比（20.27±0.45nm），SE組和CIHH+SE組大鼠海馬的突觸間隙均顯著增寬（P0.05）。雖然CIHH+SE組的突觸間隙較SE縮窄，但兩者無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（23.13±0.89nm vs.25.20±0.78nm，P0.05）。 突觸后致密物厚度：與CON組相比（30.27±0.69nm），SE組和CIHH+SE組大鼠海馬的突觸后致密物厚度均顯著降低（P0.05）；而CIHH+SE組較SE組明顯增加（27.87±0.77nm vs.22.67±0.76nm，P0.05）。 3PSD-95蛋白：與CON組相比（0.72±0.02），SE組和CIHH+SE組中大鼠海馬的胞漿內(nèi)PSD-95蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P0.05）；而CIHH+SE組中表達(dá)的水平明顯高于SE組（0.40±0.02vs.0.21±0.02，P0.05）。 Kalirin-7蛋白：與CON組相比(0.68±0.02)，SE組和CIHH+SE組中大鼠海馬胞漿內(nèi)Kalirin-7蛋白水平均顯著降低（P0.05）；而CIHH+SE組的表達(dá)水平高于SE組（0.34±0.02vs.0.26±0.02，P0.05）。 結(jié)論： PILO誘導(dǎo)的SE大鼠長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙和海馬突觸結(jié)構(gòu)的損傷。CIHH預(yù)處理可有效改善受損的突觸超微結(jié)構(gòu)并上調(diào)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，這可能是CIHH改善癲癇發(fā)作后認(rèn)知功能障礙的機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李娜;白藜蘆醇改善AD大鼠記憶的Aβ1-42轉(zhuǎn)運(yùn)及NF-κB炎性信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2277315