本文選題：Celf1 + CUGBP1��； 參考：《南昌大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:研究Celf1對(duì)模擬強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良RNA毒性致成肌分化缺陷中的部分調(diào)節(jié)作用。方法:1、C2C12成肌細(xì)胞培養(yǎng)與分化,并進(jìn)行成肌分化誘導(dǎo)。于0,1,2,4,6時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行樣品收集。2、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染,構(gòu)建GFP-CUG5和GFP-CUG200質(zhì)粒,構(gòu)建后利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入C2C12細(xì)胞中;構(gòu)建p MSCV-Celf1 Flag-puro質(zhì)粒,將Baylor醫(yī)學(xué)院Tom Cooper提供pc DNA3-Celf1Flag質(zhì)粒中含有Celf1 Flag的Eco RI片段插入p MSCV-puro質(zhì)粒,將質(zhì)粒用293T細(xì)胞包裝制備逆轉(zhuǎn)錄病毒,隨后轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞;Celf1 sh RNA慢病毒載體和對(duì)照組Scrambled sh RNA病毒由20μg sh RNA編碼的慢病毒載體和150μg包裝載體ps PAX2以及10μg包膜載體p MD2.G共同轉(zhuǎn)染入150mm培養(yǎng)皿的293T細(xì)胞中,收集上清轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞。3、抗體與免疫測(cè)定,western blot測(cè)定,按常規(guī)方法將轉(zhuǎn)膜蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。先后用Celf1單克隆鼠抗,Flag,Actin一抗孵育及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠Ig G二抗進(jìn)行孵育,增強(qiáng)熒光試劑顯色。4、實(shí)時(shí)定量RT-PCR及RT-PCR選擇性剪切分析,以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,測(cè)定Myo D(Myf3)、Myogenin(Myo G)、Mef2c、Celf1等基因在成肌分化中的變化。提取總RNA,使用特異性引物擴(kuò)增Zasp、MBNL-1、Z-TTN、M-TTN、和BIN-1,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠分,DNA條帶利用Image J軟件進(jìn)行分析。5、流式細(xì)胞術(shù)及熒光激活細(xì)胞分選(FACS),測(cè)定成肌細(xì)胞增殖及早期分化的細(xì)胞周期分布,用胰蛋白酶將細(xì)胞消化后,洗滌、固定、染色,并使用Acuri C6流式細(xì)胞儀及Flowjo軟件和Dean Jett Fox模型對(duì)結(jié)果及數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。6、細(xì)胞染色量化與統(tǒng)計(jì)分析,核融合指數(shù)計(jì)算方法為肌管內(nèi)總細(xì)胞核數(shù)(≥2 nuclei)占總細(xì)胞核數(shù)百分比�？偧」苊娣e為圖像被肌管覆蓋區(qū)域所占百分比。每組分析至少涵蓋1000個(gè)細(xì)胞核及至少3個(gè)隨機(jī)選擇區(qū)域,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用t檢驗(yàn)評(píng)估兩組差異性,P0.05。結(jié)果:1、3'非翻譯區(qū)的CUG擴(kuò)增導(dǎo)致成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期加速和分化損傷(1)α肌凝蛋白重鏈染色(MF20)可見(jiàn)GFP-CUG5組細(xì)胞肌管形成明顯,相反,GFP-CUG200肌管形成數(shù)量很少;(2)三個(gè)獨(dú)立量化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GFP-CUG5組核融合指數(shù)達(dá)(38.9±8.7)%,而GFP-CUG200組融合指數(shù)僅(2.2±0.8)%。同樣的,GFP-CUG5組肌管面積達(dá)(40.2±12.0)%,而GFP-CUG200組肌管面積僅(3.3±0.8)%;(3)RT-PCR結(jié)果顯示,CUG200在成肌細(xì)胞增殖和早期分化過(guò)程中Celf1m RNA表達(dá)顯著增加,CUG200抑制細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中Myo D的表達(dá),Myo G和Mef2C表達(dá)也被抑制,與分化缺失結(jié)果一致;(4)Western blot結(jié)果顯示CUG200組Celf1蛋白水平也相應(yīng)地上升;(5)FACS分析結(jié)果顯示,在增殖未分化的成肌細(xì)胞中,CUG200的G1期細(xì)胞顯著減少,細(xì)胞周期撤退增加。2、過(guò)表達(dá)Celf1抑制成肌細(xì)胞細(xì)胞周期撤退及損傷成肌分化(1)Western blot結(jié)果顯示,Flag標(biāo)簽Celf1僅出現(xiàn)在p MSCV-Celf1 Flag轉(zhuǎn)換細(xì)胞中,其Celf1蛋白表達(dá)水平上調(diào);(3)肌管融合指數(shù)Celf1Flag組(5.2±2.0)%而對(duì)照組為(34.9±11.7)%;肌管面積Celf1Flag組(5.4±3.0)%,對(duì)照組(29.8±12.7)%;(4)通過(guò)對(duì)肌細(xì)胞分化過(guò)程中基因表達(dá)研究,我們發(fā)現(xiàn)Celf1過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致未分化的成肌細(xì)胞Myo D表達(dá)增加,與對(duì)照組組相比,即使Myo D在分化處理當(dāng)日(day0)表達(dá)增加,在隨后分化第1日(day1)至第6日(day6)Myo D表達(dá)明顯降低,Myo G及Mef2C表達(dá)仍然被抑制,這與肌管形成缺失相符;(5)FACS細(xì)胞周期分析顯示,30.7%Celf1過(guò)表達(dá)成肌細(xì)胞停留在G1期未分化階段,而對(duì)照組G1期細(xì)胞比例43.6%,說(shuō)明Celf1過(guò)表達(dá)抑制成肌細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞周期撤退;3、敲減Celf1促進(jìn)早期成肌細(xì)胞分化(1)western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,Celf1敲減組Celf1蛋白表達(dá)下降;(2)免疫熒光染色結(jié)果顯示,在分化過(guò)程中,肌管在Celf1敲減細(xì)胞中形成增加;(3)融合指數(shù)和肌管面積分別為(45.0±7.1)%和(38.6±7.2)%,對(duì)照組分別為(22.0±1.9)%和(16.1±2.6)%;(4)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR我們發(fā)現(xiàn)Celf1敲減細(xì)胞表達(dá)是一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程。Celf1敲減細(xì)胞中Myo D,Myo G和Mef2C的表達(dá)顯著增加,支持成肌細(xì)胞分化增加的結(jié)果;(5)FACS細(xì)胞周期分析顯示:增殖期對(duì)照組細(xì)胞16.0%停留在G1期,而Celf1敲減組為16.4%;4、敲減Celf1部分挽救CUG擴(kuò)增引起的成肌分化缺陷(1)western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,Celf1敲減組Celf1蛋白表達(dá)下降;(2)MF20染色結(jié)果顯示,Celf1 sh RNA的導(dǎo)入致CUG200組成肌分化增加。與對(duì)照組相比,表達(dá)Celf1 sh RNA的成肌細(xì)胞多核肌管顯著;(3)核融合指數(shù)從(2.3±1.4)%增加至(17.6±1.1)%,相應(yīng)地,肌管面積從(4.7±3.1)%增加至(12.7±2.4)%,但Celf1敲減的成肌細(xì)胞不能完全恢復(fù)至野生型細(xì)胞成肌分化程度;(4)實(shí)時(shí)定量PCR分析Myo D,Myo G和Mef2C也支持Celf1 sh RNA部分挽救CUG擴(kuò)增導(dǎo)致的成肌分化缺陷;(5)FASC細(xì)胞周期分析提示Celf1 sh RNA糾正CUG200異常增加的細(xì)胞周期,流式細(xì)胞術(shù)及熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)結(jié)果顯示Celf1 sh RNA的CUG200成肌細(xì)胞中停留在細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比例為43.3%,顯著大于對(duì)照組G1期31.5%細(xì)胞比例;(6)選擇性剪切分析顯示,成肌細(xì)胞基因表達(dá)過(guò)程的選擇性剪切未完全被Celf1 sh RNA逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:1、Celf1在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞周末分化中起著獨(dú)立的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,是導(dǎo)致RNA毒性作用的部分原因。2、靶向Celf1可能為糾正強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良表型,尤其是成為先天性病例的有效治療策略。
[Abstract]:AIM : To study the partial regulatory effects of Celf1 on myogenic differentiation induced by acute myotonic dystrophy . Methods : 1 , C2C12 myoblasts were cultured and differentiated . 鏌撹壊,騫朵嬌鐢ˋcuri C6嫻佸紡緇嗚優(yōu)浠強(qiáng)Flowjo杞歡鍜孌ean Jett Fox妯″瀷瀵圭粨鏋滃強(qiáng)鏁版嵁榪涜鍒嗘瀽.6,緇嗚優(yōu)鏌撹壊閲忓寲涓庣粺璁″垎鏋，

本文編號(hào)：2035763