本文選題：GOLPH3 + NDRG1��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：膠質瘤(Glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤,約占顱內腫瘤的44.69%,居顱內腫瘤發(fā)病率的第一位。不可否認,對于膠質瘤發(fā)病因素及發(fā)病機理的認識有助于膠質瘤的有效預防以及尋找最新的靶向治療措施。目前,膠質瘤的治療效果依然很差,一般患者的5年生存率只有5%左右,國際上仍無良好的治療辦法,導致膠質瘤預后不佳的根本原因在于它一系列的惡性生物學行為,包括腫瘤細胞的過度增殖、對周圍腦組織的侵襲、化療藥物耐藥等,尤其是腫瘤細胞的過度增殖,是導致膠質瘤術后快速復發(fā)的重要因素。目前的治療理念是先以顯微鏡下最大限度的腫瘤手術切除為主,然后聯(lián)合放射治療及化療作為輔助治療的綜合治療,但是由于膠質瘤生長部位的特殊性以及其無節(jié)制生長的臨床特點,治療效果并不理想,腫瘤細胞的這種快速增殖和早期向周圍正常腦組織浸潤轉移,使其成為預后最差的腫瘤。自二十世紀以來,隨著分子醫(yī)學研究和腫瘤基因學的發(fā)展不斷的深入,人們對腦膠質瘤的發(fā)病機制亦取得了一些新的認識,但是仍未找到一個行之有效、具體的防治辦法和治療措施。尋找一種新的、有效的、具有較高特異度的分子基因標志物,能夠對腦膠質瘤患者進行早期的預后判斷就變得尤為重要。如何有效的抑制膠質瘤細胞的過度增殖,從而延長患者的生存期并改善其生存質量,也是目前膠質瘤治療領域的一大難題。因此,對膠質瘤細胞過度增殖的分子作用機制進行研究,并針對其進行有效的干擾和抑制,探討膠質瘤的發(fā)病機制、尋找有效的治療靶點已成為膠質瘤基因治療攻關的重點。近年來,為了探索膠質瘤的發(fā)病原因及其易感性,膠質瘤相關基因方面的研究逐漸展開,目前成為熱點。其特定的基因組及組織學特點導致膠質瘤成為復雜多因素疾病。多個研究表明,癌基因、抑癌基因和相關的調控基因均參與其中。高爾基體磷蛋白3(GOLPH3:Golgi phosphoprotein 3)被認為是外殼蛋白(coat proteins)的一種,不同于其他的細胞膜癌基因蛋白,GOLPH3大部分位于Trans-Golgi Network (TGN),由于這個原因,它被定義為第一個高爾基體的癌基因。由5p13染色體(在一些實體腫瘤中經(jīng)常擴增的染色體區(qū)域)上的基因進行編碼,通過結合基因組學、臨床病理及功能分析,人類GOLPH3被確認為是一種新的癌蛋白。2009年ScottKL等報道,GOLPH3可能是癌癥發(fā)生的一個關鍵因素,在多種實體惡性腫瘤中存在過量表達,并參與囊泡運輸、細胞分裂及蛋白質糖基化等多個腫瘤形成過程,表明GOLPH3可作為一種癌蛋白發(fā)揮作用,并推測GOLPH3在腫瘤中的作用與nTOR信號通路有關,腫瘤細胞對雷帕霉素敏感性的初步研究顯示,過表達GOLPH3可能增加AKT的活化,減少對雷帕霉素的敏感,促進細胞增殖。2009年Dippold等報道GOLPH3與高爾基體保持正常形態(tài)有關并有利于芽泡的生成。Wood等報道GOLPH3可與磷脂酰肌醇-4-磷酸(Ptdlns(4)P)結合,通過對高爾基體結構和功能的調節(jié)來控制細胞內囊泡的分泌及運輸,由此說明GOLPH3在高爾基體分泌泡形成和運輸過程中起著重要的作用。目前的研究表明GOLPH3可參與細胞內蛋白轉運、受體循環(huán)及糖基化等多種過程,作為一種癌蛋白發(fā)揮作用,這些過程與腫瘤的形成有潛在的聯(lián)系。自從第一次被證明是一個癌基因以來,GOLPH3已被大量的研究報道,在許多腫瘤中,GOLPH3的上調和患者的不良預后有關,可能通過多條信號通路促進腫瘤細胞的增殖,如mTOR/AKT通路或Writ通路等,因此GOLPH3可能是靶向藥物治療的有效基因靶點。NDRGl(N-myc downstream regulated gene 1)于1997年第一次被分離,在人體正常組織及腫瘤中均存在表達,且同時也被發(fā)現(xiàn)參與了胚胎發(fā)生發(fā)育、細胞生長分化、脂質合成、髓鞘形成、應激反應和免疫功能等多個過程。目前發(fā)現(xiàn)NDRG1的表達受多種因素的調節(jié),包括N-myc基因,組蛋白乙�；�,缺氧,細胞內鐵和鈣的水平等。多項研究已證實,NDRG1在細胞分化過程中可被誘導產(chǎn)生,其表達上調會引起粒單細胞系增殖停止,表明NDRG1可在終末分化中起到作用。有學者發(fā)現(xiàn),正常上皮細胞分化過程中其mRNA上調,而在腫瘤細胞中表達則下調,提示其可能與細胞的分化和增殖有關。在腎臟中,PKD2通過EGR1轉錄因子而使NDRG1過表達,來起到促進增殖的作用。此外,NDRG1還和微管及中心體、紡錘體酯化以及多種P53相關基因息息相關。下調NDRG1和α-微管蛋白乙�；瘻p少有關,微管蛋白的減少可影響紡錘絲的形成,并進一步影響細胞分裂。此項研究證實NDRG1在細胞有絲分裂中存在保真性和抑制基因不穩(wěn)定性的作用,減少NDRG1的表達會使基因得不穩(wěn)定性增加,并可能進一步導致腫瘤。近十余年來,研究發(fā)現(xiàn),NDRG1在胰腺癌、結腸癌等多種腫瘤中低表達,而在肝癌、子宮內膜癌、膽管癌中卻發(fā)現(xiàn),NDRG1的蛋白表達較正常組織明顯增高,說明對NDRG1的研究目前仍不一致。然而在膠質瘤中,NDRG1的表達如何,且又發(fā)揮什么樣的生物學行為,目前國內外研究較少,仍需要進一步探討。有學者發(fā)現(xiàn),GOLPH3和NDRG1均和高爾基體的囊泡運輸有關,GOLPH3定位在高爾基體可以促進囊泡的分泌,而NDRG1定位在高爾基體周圍的胞漿,NDRG1也是TGN網(wǎng)絡系統(tǒng)的一部分,可以促進囊泡內容物回收,幫助機體完成整個囊泡運輸。磷脂酰肌醇-4-磷酸(PtdIns(4)P)是高爾基體結構和功能的主要調節(jié)因素,Wood等報道GOLPH3可與PtdIns(4)P結合,并控制細胞內囊泡的分泌,而NDRG1也能并口PtdIns(4)P相結合,通過反面高爾基體的ARF1參與細胞內的囊泡運輸。另外,GOLPH3和NDRG1均和PI3K/Akt/mTOR通路、Wnt通路及細胞內細胞骨架、紡錘絲的形成有關,但GOLPH3和NDRG1的具體關系仍需進一步探討。為此,結合目前研究現(xiàn)狀,我們首先聯(lián)合檢測了GOLPH3和NDRG1在膠質瘤組織和正常腦組織中的表達情況,分析了其與不同膠質瘤病理級別的關系,并在膠質瘤細胞中研究了GOLPH3和NDRG1對膠質瘤細胞凋亡、增殖的影響,且對其潛在的關系和機制進行了探討。第一部分GOLPH3、NDRG1在膠質瘤中的表達及相關性的研究目的本實驗研究GOLPH3、NDRG1分別在正常腦組織和人腦膠質瘤組織不同病理級別中的表達,并對其表達情況與膠質瘤病理級別的關系進行研究。方法本實驗分為正常腦組織組、膠質瘤Ⅱ級組、Ⅲ級組和Ⅳ級組,正常腦組織來自于腦外傷患者需要行顱內減壓手術而取得的非壞死的正常腦組織標本。應用Real-time RT-PCR法和Western Blot法檢測34例人腦膠質瘤標本和9例正常腦組織中的GOLPH3和NDRG1的mRNA和蛋白水平,并進行統(tǒng)計學分析；應用免疫組織化學方法檢測9例正常腦組織標本和76例人腦膠質瘤組織標本中的GOLPH3和NDRG1表達情況,并分析兩種基因表達的相關性。結果1.在人腦膠質瘤組織和正常腦組織中,GOLPH3和NDRG1在mRNA水平和蛋白水平均有表達。在人腦膠質瘤中,GOLPH3的mRNA和蛋白的表達水平均高于正常腦組織,且與正常腦組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),并隨著膠質瘤的病理級別的增高而增加。而NDRG1的mRNA和蛋白表達量在正常腦組織中表達較低,在人腦膠質瘤Ⅱ級組中最高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),在膠質瘤組織中,隨著病理級別的升高,NDRG1的mRNA和蛋白表達水平逐漸降低。NDRG1的mRNA和蛋白在正常腦組織組和Ⅲ級組、Ⅳ級組中的表達無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)。在膠質瘤組織中,GOLPH3和NDRG1在嬖RNA水平和蛋白水平的表達趨勢相反。2. GOLPH3的免疫組化結果顯示,GOLPH3的陽性表達主要位于細胞內細胞核旁,相當于高爾基體位置,呈粗大顆粒狀,部分染色為細小顆粒狀,著色彌散存在于細胞質中。GOLPH3在正常腦組織組和膠質瘤組中的陽性表達率分別為22.2%(2/9)、57.9%(44/76),兩者比較(x=4.124,P0.05);Ⅱ級組39.1%(9/23),Ⅲ級組54.2%(13/24), Ⅳ級組75.9%(20/29)。這說明GOLPH3蛋白表達陽性率在膠質瘤組織中高于正常腦組織,且隨病理級別增高而升高。NDRG1的免疫組化結果顯示,NDRG1的陽性表達主要位于細胞的細胞質,也有部分表達在細胞膜或細胞的連接部位。NDRG1在正常腦組織組和膠質瘤組中的陽性表達率分別為44.4%(4/9)、46.1%(35/76),兩者比較(x=0.008,P0.05)；Ⅱ級組60.9%(14/23),Ⅲ級組,41.7%(10/24), Ⅳ級組20.6%(7/29)。在腦膠質瘤組織中,NDRG1蛋白表達陽性率隨病理級別增高呈降低的趨勢。NDRG1和GOLPH3的免疫組化陽性率情況和Western-Blot檢測的蛋白表達趨勢是一致的。結論 1、GOLPH3和NDRG1在正常腦組織和膠質瘤組織中均有表達。在膠質瘤組織中,GOLPH3的表達隨著腫瘤組織病理級別的升高逐漸升高,而NDRGl的表達隨著腫瘤組織病理級別的升高逐漸減低。2. GOLPH3和NDRGl在膠質瘤中的表達呈負相關。第二部分GOLPH3和NDRG1對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡及相關機制的研究目的探討GOLPH3和NDRG1對膠質瘤細胞凋亡、增殖的影響及兩者之間的關系、可能機制,為膠質瘤治療提供潛在的基因治療分子靶點。方法 1.在膠質瘤細胞U251及U87中,用lipofectamine2000轉染GOLPH3或NDRG1的siRNA,用Polyjet轉染GOLPH3或NDRG1的過表達質粒。2.運用Western Blot檢測其蛋白表達水平；流式細胞術檢測GOLPH3siRNA,NDRG1 siRNA、GOLPH3過表達質粒及NDRG1過表達質粒對U87、U251細胞凋亡的影響；CCK-8法檢測細胞增殖情況。結果 1.下調GOLPH3或過表達NDRG1后,膠質瘤U251、U87細胞的凋亡增多,增殖能力下降,過表達GOLPH3或下調NDRG1后,膠質瘤U251、U87細胞的凋亡減少,增殖能力升高。2.在膠質瘤U251細胞系中下調GOLPH3后,NDRG1、cleaved-caspase3的蛋白表達水平明顯增加,過表達GOLPH3后,NDRG1、cleaved-caspase3的蛋白表達水平明顯減少。3.在膠質瘤U251細胞系中下調NDRG1, GOLPH3的蛋白表達水平變化無統(tǒng)計學意義,cleaved-caspase3的蛋白表達水平減少。結論1.下調GOLPH3或過表達NDRG1促進細胞的凋亡,減少增殖,而過表達GOLPH3或下調NDRG1則減少細胞的凋亡,促進增殖。GOLPH3和NDRG1均和膠質瘤細胞的凋亡,增殖有關,有可能成為膠質瘤治療的新靶點。2. GOLPH3可能位于NDRG1的上游,干擾GOLPH3可通過上調NDRG1并增加cleaved-caspase3的表達來促進膠質瘤細胞的凋亡。
[Abstract]:Gliomas are the most common tumors in the central nervous system , accounting for 44.69 % of the intracranial tumors , the first in the incidence of intracranial tumors . GOLPH3 ( GOLPH3 ) plays an important role in the formation and transport of cancer proteins . It is suggested that GOLPH3 can be involved in the formation and transport of tumor cells . The expression of NDRG1 and NDRG1 is related to the differentiation and proliferation of NDRG1 . In addition , the expression of NDRG1 and NDRG1 is related to the cell differentiation and proliferation . Methods The mRNA and protein levels of GOLPH3 and NDRG1 in 34 human glioma specimens and 9 normal brain tissues were detected by Real - time RT - PCR and Western Blot .
The expression levels of GOLPH3 and NDRG1 in normal brain tissues were significantly higher than those in normal brain tissues ( P < 0.05 ) . The positive expression rates of GOLPH3 in normal brain tissue group and glioma group were 22.2 % ( 2 / 9 ) and 57.9 % ( 44 / 76 ) respectively . The positive expression rates of GOLPH3 in normal brain tissue group and glioma group were 22.2 % ( 9 / 23 ) , 54.2 % ( 13 / 24 ) and 75.9 % ( 20 / 29 ) respectively .
The positive rates of NDRG1 and NDRG1 were consistent with the pathological grade . Conclusion The expression of GOLPH3 and NDRG1 is consistent with the pathological grade . Conclusion The expression of GOLPH3 and NDRG1 is gradually increased with the pathological grade of tumor tissue , while the expression of NDRG1 decreases with the pathological grade of tumor tissue . The effects of GOLPH3 and NDRG1 on the proliferation , apoptosis and related mechanisms of human glioma cells were investigated . The effects of GOLPH3 and NDRG1 on apoptosis and proliferation of glioma cells were investigated .
Flow cytometry was used to detect the effects of GOLPH3 siRNA , NDRG1 siRNA , GOLPH3 overexpression plasmid and NDRG1 overexpression plasmid on apoptosis of U87 and U251 cells .
Results 1 . After downregulating GOLPH3 or overexpression of NDRG1 , the protein expression level of glioma U251 , U87 cells increased significantly , and the protein expression level of glioma U251 and U87 decreased significantly . GOLPH3 may be located upstream of NDRG1 and interfere with GOLPH3 to promote apoptosis of glioma cells by up - regulation of NDRG1 and increasing expression of caspase - caspase3 .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【引證文獻】

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1 丁響;陳謙學;;GOLPH3在膠質瘤中的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2017年20期

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本文編號：1994164