本文選題：面神經損傷 + 雪旺氏細胞�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：[研究背景]解剖學研究發(fā)現(xiàn)走行于顳骨部的面神經由于通過堅硬狹窄的骨性面神經管,在損傷后水腫缺血不能及時緩解,最終導致變性壞死,出現(xiàn)不同程度的面神經癱瘓。由于目前缺乏理想的治療手段,所以研究面神經水腫發(fā)生機制,找到水腫損傷形成和持續(xù)的方法,避免面神經進一步變性壞死是面神經損傷治療的方向之一。水通道蛋白(AQPs)是一類高效介導跨膜水轉運的特異性通道蛋白,在水液代謝的調節(jié)中起重要作用,參與人體多種組織器官水腫的形成和消除。前期通過動物面神經損傷模型的研究,AQP1在面神經組織上表達趨勢與神經水腫程度相似,且主要定位于雪旺氏細胞上,調控其表達可調節(jié)雪旺氏細胞的腫脹程度。根據研究報道乙酰唑胺能有效抑制AQP1的表達,我們也在前期工作中證實乙酰唑胺對雪旺氏細胞表達有負性調節(jié)作用。但是對于AQP1在雪旺氏細胞和面神經水腫形成過程中的表達調控機制,目前尚無研究報道。由于目前缺乏從整體水平對AQPs的功能及其表達調控機制進行研究,因此,結合前期研究基礎,本課題通過對雪旺氏細胞水腫模型和面神經損傷動物模型的研究,運用細胞生物學、分子生物學等實驗方法分別在體外和體內研究水腫狀態(tài)下AQP1的表達調控機制及乙酰唑胺干預條件下對AQP1的調控機制,并探討其相互之間的關系,為治療早期面神經水腫提供全新的方向。[目的]1、研究AQP1表達變化與雪旺氏細胞水腫的關系及其表達調控機制;2、研究乙酰唑胺對AQP1表達調控與雪旺氏細胞水腫之間的關系;3、在面神經損傷動物模型上進一步驗證調控AQP1表達導致面神經水腫的相關機制,為臨床以水通道蛋白為靶點預防或治療早期面神經水腫提供新思路。[方法]一、滲透壓改變對雪旺氏細胞AQP1表達的影響及其表達調控的實驗研究1、低滲液對大鼠雪旺氏細胞生物學特性及AQP1表達變化的影響A. RSC96大鼠雪旺氏細胞系培養(yǎng)及鑒定(1)細胞貼壁培養(yǎng),細胞形態(tài)觀察;(2)免疫熒光雙標染色:S-100 (雪旺氏細胞特異性標志物)及AQP1表達;(3)蛋白質印跡法檢測雪旺氏細胞中AQP1表達。B.構建低滲細胞水腫模型(1) 2組低滲液240mmol/L、150 mmol/L誘導細胞水腫;(2) CCK-8細胞活力檢測及流式細胞早期凋亡評估模型標準及時間點;(3)低滲誘導細胞水腫形態(tài)變化及confocal動態(tài)監(jiān)測細胞體積變化;(4)免疫熒光及Western-blot檢測細胞水腫AQP1表達變化。2、滲透壓改變對雪旺氏細胞MAPK信號通路的影響(1)復制細胞水腫模型;(2)細胞水腫模型分組:2組低滲液240mmol/L、150mmol/L,對照組以常規(guī)無血清DMEM培養(yǎng);(3) Westem-blot檢測MAPK各亞組蛋白磷酸化水平變化。3、MAPK在雪旺氏細胞水腫中對AQP1表達調控的實驗研究(1)復制細胞水腫模型;(2)細胞水腫模型分組:ERK/p38組;對照組,模型組,抑制劑干預組,干預組將待處理細胞預先加入MAPK特異性抑制劑作用1h后,再加入低滲液體;(3) Western-blot 檢測 AQP1 表達變化。二、乙酰唑胺對大鼠雪旺氏細胞AQP1表達調控的初步研究1、慢病毒介導的AQP1過表達對大鼠雪旺氏細胞生物學特性影響的實驗研究(1)AQP1過表達構建:將目的基因克隆到慢病毒載體,鑒定克隆正確連接(PCR和測序),過表達質粒與包裝質粒共轉染293T細胞,慢病毒轉染雪旺氏細胞制備AQP1過表達穩(wěn)轉株模型;(2)細胞周期測定過表達細胞與陰性對照細胞差異;(3)免疫熒光半定量及蛋白質印跡法檢測感染后雪旺氏細胞AQP1蛋白表達變化。2、乙酰唑胺AZA抑制AQP1表達與MAPK信號級聯(lián)之間的實驗研究(1)利用CCK-8檢測乙酰唑胺對雪旺氏細胞毒性,篩選合適的藥物濃度;(2)不同濃度梯度的AZA作用于過表達穩(wěn)轉株(OE),Westem-blot檢測干預12h后AQP1蛋白變化情況;(3) AZA干預AQP1過表達穩(wěn)轉株后,免疫印跡法觀察0-12h MAPK蛋白磷酸化變化水平;(4)細胞分為正常對照組,乙酰唑胺抑制組,乙酰唑胺抑制干預組,干預組將待處理細胞預先加入MAPK特異性抑制劑作用1h后,再加入乙酰唑胺干預12h,觀察AQP1蛋白變化情況。3、AZA對AQP1表達變化的穿梭機制研究(1)利用構建的OE進行免疫沉淀(IP),將沉淀的蛋白液行質譜分析,篩選可能與AQP1互相作用的細胞骨架蛋白(MYH14)及泛素蛋白(Ub);利用免疫熒光共標染色驗證AQP1與MYH14、Ub細胞內共定位;重復IP試驗,驗證乙酰唑胺干預下AQP1與MYH14的相互作用;(2) AZA干預OE12h,利用膜蛋白提取試劑盒提取細胞膜及細胞漿蛋白,免疫印跡法觀察AZA干預后A.QP1轉位表達情況;(3) MYH14-shRNA質粒構建與轉染:將目的基因克隆到慢病毒載體,鑒定克隆正確連接(PCR和測序),質粒轉染雪旺氏細胞,構建的MYH14-shRNA利用免疫熒光觀察轉染效率,免疫印跡驗證MYH14蛋白敲除水平;(4) MYH14-shRNA對細胞活力影響及泛素化抑制劑MG132藥物濃度行CCK-8檢測;(5)細胞分為正常對照組,AZA抑制組,AZA抑制干預組,干預組將待處理細胞預先敲除MYH14,再加入AZA,觀察AQP1蛋白轉位變化情況;(6)細胞分組正常對照組,乙酰唑胺抑制組,泛素抑制劑組、泛素抑制劑+乙酰唑胺干預組,干預組將待處理細胞預先MG132處理1h,再加入AZA,觀察AQP1蛋白變化情況。三、AQP1在面神經水腫中的表達調控及治療機制的實驗研究1、大鼠面神經損傷模型的構建及評估(1)耳后切口入路構建大鼠面神經損傷模型:Wistar大鼠左側:手術側,右側:自身對照側;術后14天,對面神經核團區(qū)的腦干部位連續(xù)冰凍切片,對核團神經元計數(shù);對面神經功能評分;(2)解剖獲取面神經顳骨段面神經組織進行組織切片,免疫組化觀察AQP1的分布和表達,判斷AQP1的時相性變化;(3)免疫印跡法對顳骨段面神經組織內的AQP1蛋白的表達進行檢測,驗證AQP1蛋白水平的時相性變化趨勢;2、面神經損傷對大鼠面神經組織MAPK信號通路的影響(1)重復構建動物模型,免疫印跡法檢測面神經水腫形成時間內MAPK蛋白磷酸化變化情況;(2)動物模型分組,MAPK抑制劑篩選濃度驗證體內ERK/p38抑制水平;3、MAPK在面神經水腫中對AQP1表達調控的實驗研究動物模型分為ERK/p38兩組:正常對照組,模型組,模型干預組,抑制劑空白對照組,干預組及抑制劑空白對照組術前給予預實驗中摸索的藥物濃度及給藥方式,手術造模,免疫印跡法觀察AQP1蛋白變化情況;四、數(shù)據統(tǒng)計學分析獲得結果,為后續(xù)研究開辟思路。[結果]1、RSC96大鼠雪旺氏細胞表達AQP1,在不同滲透壓誘導下,細胞水腫形成,AQP1 均于 6h 達高峰(150mM: P0.001,240mM: P0.01);2、不同濃度的低滲溶液作用后均能激活p-ERK和p-p38蛋白磷酸化水平;150mmol/L組:p-ERK在30min時表達最強(P0.001),p-p38在1h時表達最強(P0.001); 240mmol/L 組:p-ERK 在 15min 時達最強(P0.001),p-p38 在 5min時達最強(P0.001)。ERK抑制劑U0126中,兩組低滲濃度組AQP1表達較低滲刺激組均明顯降低(150mmol/L: P0.05; 240mmol/L: P0.001),與對照組無明顯統(tǒng)計學差異;p38抑制劑SB203580組AQP1蛋白表達較低滲處理降低(150mmol/L: P0.05; 240mmol/L: P0.001),但仍高于正常對照組水平(P0.01 )。3、構建的AQP1過表達載體測序正確,轉染雪旺氏細胞后AQP1蛋白表達明顯增加(P0.001);乙酰唑胺干預12h后,蛋白水平明顯降低(10-5mol/L:P0.001,10-6mol/L: P0.01),AQP1 下調呈濃度依賴性(10-5:1 0-6mol/L: P0.05);4、乙酰唑胺干預細胞0-12h, p-ERK磷酸化水平6h表達最強(P0.001 )。ERK抑制劑U0126作用于細胞后,能明顯阻斷乙酰唑胺對AQP1的抑制作用(P0.05);5、MYH14-shRNA質粒測序正確,轉染雪旺氏細胞后MYH14蛋白水平下降(P0.01),并對雪旺氏細胞活力無影響;6、乙酰唑胺干預細胞后,激活MAPK信號通路,下游細胞骨架蛋白MYH14與AQP1相互作用,從細胞漿向細胞膜轉位,1h時表達量最高(P0.01),MYH14-shRNA轉染細胞后,AQP1轉位現(xiàn)象消失,膜AQP1表達下調(P0.05);7、細胞預處理MG132,泛素蛋白酶體通路被抑制,AZA對AQP1抑制作用消失(P0.001),證明AZA通過AQP1轉位在細胞膜上激活泛素通路而降解;8、大鼠面神經損傷行為學觀察,面神經功能評分均符合面癱指標,面神經核團計數(shù)低于對照側(P0.05);免疫組化及免疫印跡分析均在術后7dAQP1表達最高(P0.001);9、面神經損傷后大鼠體內激活ERK/p38信號通路,p-ERK/p-p38均在術后3d時達最強(P0.001),ERK抑制劑U0126,抑制劑干預組AQP1表達模型組降低(P0.001),與對照組無明顯統(tǒng)計學差異;p38抑制劑SB203580組AQP1蛋白表達較模型組降低(P0.001),結論同細胞學水平類似,說明MAPK信號通路有可能參與面神經水腫形成中對AQP1表達調控。[結論]1、AQP1參與雪旺氏細胞水腫形成;2、MAPK在低滲誘導細胞水腫形成中參與AQP1的表達調控;3、乙酰唑胺在細胞內通過穿梭機制及泛素蛋白酶體通路完成對AQP1的表達調控;4、MAPK可能在大鼠面神經水腫形成中參與AQP1的表達調控。
[Abstract]:Objective : To study the relationship between AQP1 expression and the expression of AQP1 and to explore the relationship between AQP1 expression and the expression of AQP1 . The expression of AQP1 in Schwann cells was studied by Western - blot . The expression of AQP1 protein was determined by using CCK - 8 . The expression of AQP1 protein was observed by Western blotting . ( 3 ) The expression of AQP1 was detected by Western blot . The expression of AQP1 protein in facial nerve tissue was studied by immunohistochemistry . The expression of AQP1 protein was significantly lower than that in normal control group ( P 0.001 ) . The expression of AQP1 protein in the group was lower than that in normal control group ( P 0.001 ) . The expression of AQP1 protein in the group of the inhibitor SB203580 was lower than that in the control group ( P 0.01 ) . The level of p - ERK phosphorylation was strongest at 6h - 12h and 6h after acetazolamide ( P0.001 ) . The results showed that the expression of AQP1 was highest at 3 days ( P 0.01 ) , and the level of AQP1 was decreased ( P < 0.01 ) .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R745.12

【參考文獻】

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本文編號：1814387