本文選題：面神經(jīng)損傷 + 雪旺氏細(xì)胞��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：[研究背景]解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)走行于顳骨部的面神經(jīng)由于通過堅(jiān)硬狹窄的骨性面神經(jīng)管,在損傷后水腫缺血不能及時(shí)緩解,最終導(dǎo)致變性壞死,出現(xiàn)不同程度的面神經(jīng)癱瘓。由于目前缺乏理想的治療手段,所以研究面神經(jīng)水腫發(fā)生機(jī)制,找到水腫損傷形成和持續(xù)的方法,避免面神經(jīng)進(jìn)一步變性壞死是面神經(jīng)損傷治療的方向之一。水通道蛋白(AQPs)是一類高效介導(dǎo)跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性通道蛋白,在水液代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用,參與人體多種組織器官水腫的形成和消除。前期通過動(dòng)物面神經(jīng)損傷模型的研究,AQP1在面神經(jīng)組織上表達(dá)趨勢與神經(jīng)水腫程度相似,且主要定位于雪旺氏細(xì)胞上,調(diào)控其表達(dá)可調(diào)節(jié)雪旺氏細(xì)胞的腫脹程度。根據(jù)研究報(bào)道乙酰唑胺能有效抑制AQP1的表達(dá),我們也在前期工作中證實(shí)乙酰唑胺對雪旺氏細(xì)胞表達(dá)有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。但是對于AQP1在雪旺氏細(xì)胞和面神經(jīng)水腫形成過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,目前尚無研究報(bào)道。由于目前缺乏從整體水平對AQPs的功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,因此,結(jié)合前期研究基礎(chǔ),本課題通過對雪旺氏細(xì)胞水腫模型和面神經(jīng)損傷動(dòng)物模型的研究,運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法分別在體外和體內(nèi)研究水腫狀態(tài)下AQP1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及乙酰唑胺干預(yù)條件下對AQP1的調(diào)控機(jī)制,并探討其相互之間的關(guān)系,為治療早期面神經(jīng)水腫提供全新的方向。[目的]1、研究AQP1表達(dá)變化與雪旺氏細(xì)胞水腫的關(guān)系及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制;2、研究乙酰唑胺對AQP1表達(dá)調(diào)控與雪旺氏細(xì)胞水腫之間的關(guān)系;3、在面神經(jīng)損傷動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證調(diào)控AQP1表達(dá)導(dǎo)致面神經(jīng)水腫的相關(guān)機(jī)制,為臨床以水通道蛋白為靶點(diǎn)預(yù)防或治療早期面神經(jīng)水腫提供新思路。[方法]一、滲透壓改變對雪旺氏細(xì)胞AQP1表達(dá)的影響及其表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究1、低滲液對大鼠雪旺氏細(xì)胞生物學(xué)特性及AQP1表達(dá)變化的影響A. RSC96大鼠雪旺氏細(xì)胞系培養(yǎng)及鑒定(1)細(xì)胞貼壁培養(yǎng),細(xì)胞形態(tài)觀察;(2)免疫熒光雙標(biāo)染色:S-100 (雪旺氏細(xì)胞特異性標(biāo)志物)及AQP1表達(dá);(3)蛋白質(zhì)印跡法檢測雪旺氏細(xì)胞中AQP1表達(dá)。B.構(gòu)建低滲細(xì)胞水腫模型(1) 2組低滲液240mmol/L、150 mmol/L誘導(dǎo)細(xì)胞水腫;(2) CCK-8細(xì)胞活力檢測及流式細(xì)胞早期凋亡評估模型標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)間點(diǎn);(3)低滲誘導(dǎo)細(xì)胞水腫形態(tài)變化及confocal動(dòng)態(tài)監(jiān)測細(xì)胞體積變化;(4)免疫熒光及Western-blot檢測細(xì)胞水腫AQP1表達(dá)變化。2、滲透壓改變對雪旺氏細(xì)胞MAPK信號通路的影響(1)復(fù)制細(xì)胞水腫模型;(2)細(xì)胞水腫模型分組:2組低滲液240mmol/L、150mmol/L,對照組以常規(guī)無血清DMEM培養(yǎng);(3) Westem-blot檢測MAPK各亞組蛋白磷酸化水平變化。3、MAPK在雪旺氏細(xì)胞水腫中對AQP1表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究(1)復(fù)制細(xì)胞水腫模型;(2)細(xì)胞水腫模型分組:ERK/p38組;對照組,模型組,抑制劑干預(yù)組,干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先加入MAPK特異性抑制劑作用1h后,再加入低滲液體;(3) Western-blot 檢測 AQP1 表達(dá)變化。二、乙酰唑胺對大鼠雪旺氏細(xì)胞AQP1表達(dá)調(diào)控的初步研究1、慢病毒介導(dǎo)的AQP1過表達(dá)對大鼠雪旺氏細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究(1)AQP1過表達(dá)構(gòu)建:將目的基因克隆到慢病毒載體,鑒定克隆正確連接(PCR和測序),過表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,慢病毒轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞制備AQP1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株模型;(2)細(xì)胞周期測定過表達(dá)細(xì)胞與陰性對照細(xì)胞差異;(3)免疫熒光半定量及蛋白質(zhì)印跡法檢測感染后雪旺氏細(xì)胞AQP1蛋白表達(dá)變化。2、乙酰唑胺AZA抑制AQP1表達(dá)與MAPK信號級聯(lián)之間的實(shí)驗(yàn)研究(1)利用CCK-8檢測乙酰唑胺對雪旺氏細(xì)胞毒性,篩選合適的藥物濃度;(2)不同濃度梯度的AZA作用于過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株(OE),Westem-blot檢測干預(yù)12h后AQP1蛋白變化情況;(3) AZA干預(yù)AQP1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株后,免疫印跡法觀察0-12h MAPK蛋白磷酸化變化水平;(4)細(xì)胞分為正常對照組,乙酰唑胺抑制組,乙酰唑胺抑制干預(yù)組,干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先加入MAPK特異性抑制劑作用1h后,再加入乙酰唑胺干預(yù)12h,觀察AQP1蛋白變化情況。3、AZA對AQP1表達(dá)變化的穿梭機(jī)制研究(1)利用構(gòu)建的OE進(jìn)行免疫沉淀(IP),將沉淀的蛋白液行質(zhì)譜分析,篩選可能與AQP1互相作用的細(xì)胞骨架蛋白(MYH14)及泛素蛋白(Ub);利用免疫熒光共標(biāo)染色驗(yàn)證AQP1與MYH14、Ub細(xì)胞內(nèi)共定位;重復(fù)IP試驗(yàn),驗(yàn)證乙酰唑胺干預(yù)下AQP1與MYH14的相互作用;(2) AZA干預(yù)OE12h,利用膜蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞膜及細(xì)胞漿蛋白,免疫印跡法觀察AZA干預(yù)后A.QP1轉(zhuǎn)位表達(dá)情況;(3) MYH14-shRNA質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染:將目的基因克隆到慢病毒載體,鑒定克隆正確連接(PCR和測序),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞,構(gòu)建的MYH14-shRNA利用免疫熒光觀察轉(zhuǎn)染效率,免疫印跡驗(yàn)證MYH14蛋白敲除水平;(4) MYH14-shRNA對細(xì)胞活力影響及泛素化抑制劑MG132藥物濃度行CCK-8檢測;(5)細(xì)胞分為正常對照組,AZA抑制組,AZA抑制干預(yù)組,干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先敲除MYH14,再加入AZA,觀察AQP1蛋白轉(zhuǎn)位變化情況;(6)細(xì)胞分組正常對照組,乙酰唑胺抑制組,泛素抑制劑組、泛素抑制劑+乙酰唑胺干預(yù)組,干預(yù)組將待處理細(xì)胞預(yù)先MG132處理1h,再加入AZA,觀察AQP1蛋白變化情況。三、AQP1在面神經(jīng)水腫中的表達(dá)調(diào)控及治療機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究1、大鼠面神經(jīng)損傷模型的構(gòu)建及評估(1)耳后切口入路構(gòu)建大鼠面神經(jīng)損傷模型:Wistar大鼠左側(cè):手術(shù)側(cè),右側(cè):自身對照側(cè);術(shù)后14天,對面神經(jīng)核團(tuán)區(qū)的腦干部位連續(xù)冰凍切片,對核團(tuán)神經(jīng)元計(jì)數(shù);對面神經(jīng)功能評分;(2)解剖獲取面神經(jīng)顳骨段面神經(jīng)組織進(jìn)行組織切片,免疫組化觀察AQP1的分布和表達(dá),判斷AQP1的時(shí)相性變化;(3)免疫印跡法對顳骨段面神經(jīng)組織內(nèi)的AQP1蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測,驗(yàn)證AQP1蛋白水平的時(shí)相性變化趨勢;2、面神經(jīng)損傷對大鼠面神經(jīng)組織MAPK信號通路的影響(1)重復(fù)構(gòu)建動(dòng)物模型,免疫印跡法檢測面神經(jīng)水腫形成時(shí)間內(nèi)MAPK蛋白磷酸化變化情況;(2)動(dòng)物模型分組,MAPK抑制劑篩選濃度驗(yàn)證體內(nèi)ERK/p38抑制水平;3、MAPK在面神經(jīng)水腫中對AQP1表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究動(dòng)物模型分為ERK/p38兩組:正常對照組,模型組,模型干預(yù)組,抑制劑空白對照組,干預(yù)組及抑制劑空白對照組術(shù)前給予預(yù)實(shí)驗(yàn)中摸索的藥物濃度及給藥方式,手術(shù)造模,免疫印跡法觀察AQP1蛋白變化情況;四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析獲得結(jié)果,為后續(xù)研究開辟思路。[結(jié)果]1、RSC96大鼠雪旺氏細(xì)胞表達(dá)AQP1,在不同滲透壓誘導(dǎo)下,細(xì)胞水腫形成,AQP1 均于 6h 達(dá)高峰(150mM: P0.001,240mM: P0.01);2、不同濃度的低滲溶液作用后均能激活p-ERK和p-p38蛋白磷酸化水平;150mmol/L組:p-ERK在30min時(shí)表達(dá)最強(qiáng)(P0.001),p-p38在1h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)(P0.001); 240mmol/L 組:p-ERK 在 15min 時(shí)達(dá)最強(qiáng)(P0.001),p-p38 在 5min時(shí)達(dá)最強(qiáng)(P0.001)。ERK抑制劑U0126中,兩組低滲濃度組AQP1表達(dá)較低滲刺激組均明顯降低(150mmol/L: P0.05; 240mmol/L: P0.001),與對照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;p38抑制劑SB203580組AQP1蛋白表達(dá)較低滲處理降低(150mmol/L: P0.05; 240mmol/L: P0.001),但仍高于正常對照組水平(P0.01 )。3、構(gòu)建的AQP1過表達(dá)載體測序正確,轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞后AQP1蛋白表達(dá)明顯增加(P0.001);乙酰唑胺干預(yù)12h后,蛋白水平明顯降低(10-5mol/L:P0.001,10-6mol/L: P0.01),AQP1 下調(diào)呈濃度依賴性(10-5:1 0-6mol/L: P0.05);4、乙酰唑胺干預(yù)細(xì)胞0-12h, p-ERK磷酸化水平6h表達(dá)最強(qiáng)(P0.001 )。ERK抑制劑U0126作用于細(xì)胞后,能明顯阻斷乙酰唑胺對AQP1的抑制作用(P0.05);5、MYH14-shRNA質(zhì)粒測序正確,轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞后MYH14蛋白水平下降(P0.01),并對雪旺氏細(xì)胞活力無影響;6、乙酰唑胺干預(yù)細(xì)胞后,激活MAPK信號通路,下游細(xì)胞骨架蛋白MYH14與AQP1相互作用,從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,1h時(shí)表達(dá)量最高(P0.01),MYH14-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,AQP1轉(zhuǎn)位現(xiàn)象消失,膜AQP1表達(dá)下調(diào)(P0.05);7、細(xì)胞預(yù)處理MG132,泛素蛋白酶體通路被抑制,AZA對AQP1抑制作用消失(P0.001),證明AZA通過AQP1轉(zhuǎn)位在細(xì)胞膜上激活泛素通路而降解;8、大鼠面神經(jīng)損傷行為學(xué)觀察,面神經(jīng)功能評分均符合面癱指標(biāo),面神經(jīng)核團(tuán)計(jì)數(shù)低于對照側(cè)(P0.05);免疫組化及免疫印跡分析均在術(shù)后7dAQP1表達(dá)最高(P0.001);9、面神經(jīng)損傷后大鼠體內(nèi)激活ERK/p38信號通路,p-ERK/p-p38均在術(shù)后3d時(shí)達(dá)最強(qiáng)(P0.001),ERK抑制劑U0126,抑制劑干預(yù)組AQP1表達(dá)模型組降低(P0.001),與對照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;p38抑制劑SB203580組AQP1蛋白表達(dá)較模型組降低(P0.001),結(jié)論同細(xì)胞學(xué)水平類似,說明MAPK信號通路有可能參與面神經(jīng)水腫形成中對AQP1表達(dá)調(diào)控。[結(jié)論]1、AQP1參與雪旺氏細(xì)胞水腫形成;2、MAPK在低滲誘導(dǎo)細(xì)胞水腫形成中參與AQP1的表達(dá)調(diào)控;3、乙酰唑胺在細(xì)胞內(nèi)通過穿梭機(jī)制及泛素蛋白酶體通路完成對AQP1的表達(dá)調(diào)控;4、MAPK可能在大鼠面神經(jīng)水腫形成中參與AQP1的表達(dá)調(diào)控。
[Abstract]:Objective : To study the relationship between AQP1 expression and the expression of AQP1 and to explore the relationship between AQP1 expression and the expression of AQP1 . The expression of AQP1 in Schwann cells was studied by Western - blot . The expression of AQP1 protein was determined by using CCK - 8 . The expression of AQP1 protein was observed by Western blotting . ( 3 ) The expression of AQP1 was detected by Western blot . The expression of AQP1 protein in facial nerve tissue was studied by immunohistochemistry . The expression of AQP1 protein was significantly lower than that in normal control group ( P 0.001 ) . The expression of AQP1 protein in the group was lower than that in normal control group ( P 0.001 ) . The expression of AQP1 protein in the group of the inhibitor SB203580 was lower than that in the control group ( P 0.01 ) . The level of p - ERK phosphorylation was strongest at 6h - 12h and 6h after acetazolamide ( P0.001 ) . The results showed that the expression of AQP1 was highest at 3 days ( P 0.01 ) , and the level of AQP1 was decreased ( P < 0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R745.12

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1814387