本文選題：腦膠質(zhì)瘤 + Diaph1��； 參考：《上海大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景與目的:腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤,由膠質(zhì)細(xì)胞癌變產(chǎn)生。腦膠質(zhì)瘤具有高侵襲性和高致死率,腫瘤細(xì)胞呈浸潤性生長,與周圍正常腦組織邊界不清,手術(shù)切除無法根治。因此,在分子水平上尋找治療腦膠質(zhì)瘤的有效靶基因是目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。哺乳動物透明基因相關(guān)成蛋白1(Diaph1)是一種肌動蛋白成核因子,與早期發(fā)現(xiàn)的黑腹果蠅Diaphanous蛋白、鼠的肢體畸形蛋白等結(jié)構(gòu)相似,有兩個保守的成蛋白同源結(jié)構(gòu)域。Diaph1參與了多種以肌動蛋白為基礎(chǔ)的生物學(xué)過程,如偽足與細(xì)胞極性的形成、細(xì)胞黏附和運動等,并在病理情況下有過表達(dá)。本研究旨在探討Diaph1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲與遷移過程中的作用及機(jī)制,增加我們對Diaph1作為腦膠質(zhì)瘤重要節(jié)點分子的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的了解,為Diaph1研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供重要的理論依據(jù)。研究方法:1.通過組織免疫化學(xué)染色的方法檢測Diaph1蛋白在人惡性腦膠質(zhì)瘤組織和人正常腦組織中的表達(dá)情況;采用免疫熒光染色的方法檢測Diaph1蛋白在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中的表達(dá)情況。2.構(gòu)建Diaph1 RNA干擾質(zhì)粒,下調(diào)U87和U251中Diaph1的表達(dá),并用熒光實時定量PCR、Western blot檢測干擾效率。3.下調(diào)U87和U251中Diaph1表達(dá)后,分別采用細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞凋亡實驗和細(xì)胞劃線實驗檢測細(xì)胞的增殖能力,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力及細(xì)胞侵襲與遷移能力的變化情況。4.下調(diào)U87和U251中的Diaph1表達(dá)后,分別采用熒光實時定量PCR、Western blot和明膠酶譜方法檢測下胞內(nèi)MMP2和MMP9的m RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平及胞外活性MMP2和MMP9量的變化情況。5.構(gòu)建CRISPR/Cas9/g RNA-Diaph1敲除質(zhì)粒對U87和U251中Diaph1基因進(jìn)行敲除,并用Western blot檢測敲除效果。6.采用Western blot方法檢測敲除U87和U251中Diaph1基因表達(dá)對細(xì)胞中E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin蛋白表達(dá)水平的影響。7.采用免疫熒光染色的方法檢測U87和U251中,內(nèi)源性Diaph1與E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin之間是否存在分布上的共定位。8.采用免疫共沉淀的方法檢測腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中,內(nèi)源性Diaph1與E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin之間是否存在相互作用。9.使用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建以Diaph1為中心的人類細(xì)胞PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并對圖中的基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果:1.Diaph1蛋白在人惡性腦膠質(zhì)瘤組織和人正常腦組織中均有表達(dá),表達(dá)量與腫瘤惡性程度呈正相關(guān);Diaph1蛋白在U87和U251中均有分布,且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。2.成功構(gòu)建Diaph1 RNA干擾質(zhì)粒,該質(zhì)粒能夠有效下調(diào)U87和U251中的Diaph1m RNA和蛋白表達(dá)。3.轉(zhuǎn)染Diaph1 RNA干擾質(zhì)粒的U87和U251細(xì)胞增殖能力受到抑制,凋亡能力增強(qiáng),侵襲與遷移能力減弱。4.轉(zhuǎn)染Diaph1 RNA干擾質(zhì)粒可降低U87和U251細(xì)胞表達(dá)MMP2和MMP9m RNA和蛋白質(zhì)的水平并減少細(xì)胞向胞外分泌活性MMP2和MMP9的量。5.成功構(gòu)建CRISPR/Cas9/g RNA-Diaph1敲除質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后U87和U251中Diaph1蛋白幾乎不表達(dá)。6.轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9/g RNA-Diaph1敲除質(zhì)粒的U87和U251中E-Cadherin和α-Catenin蛋白表達(dá)水平有一定升高,α-Tubulin表達(dá)水平無變化。7.U87和U251中,內(nèi)源性Diaph1與E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin存在分布上的共定位。8.U87和U251中,內(nèi)源性Diaph1與E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin之間存在一定程度的相互作用關(guān)系。9.成功構(gòu)建以Diaph1為中心的人類細(xì)胞的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,對網(wǎng)絡(luò)中的60個基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析,并預(yù)測泛素C與Src蛋白可能是參與Diaph1功能的關(guān)鍵蛋白。結(jié)論:本研究探討了下調(diào)Diaph1的表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251增值能力、凋亡能力,侵襲與遷移能力的重要影響,并進(jìn)一步揭示了Diaph1在腦膠質(zhì)瘤中可能的作用機(jī)制,對Diaph1的深入研究方向進(jìn)行預(yù)測,為該基因應(yīng)用于臨床上腦膠質(zhì)瘤治療提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:The expression of Diaph1 protein in human malignant glioma cell line U87 and U251 was investigated by means of immunofluorescence staining . In U87 and U251 , endogenous Diaph1 and E - cadherin , 偽 - Cavities and 偽 - Tubulin in U87 and U251 were successfully constructed .

【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1746080