本文選題：雪旺細(xì)胞　切入點(diǎn)：RSC96細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景： 周?chē)窠?jīng)損傷在全世界范圍內(nèi)發(fā)生率及致殘率都很高。在周?chē)窠?jīng)損傷眾多類型中,神經(jīng)干的橫斷性損傷,特別是造成較長(zhǎng)神經(jīng)節(jié)段缺損的患者預(yù)后不好,為了促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù),往往選用外科的重建手術(shù)。因此如何修復(fù)損傷的周?chē)窠?jīng)成為了神經(jīng)科學(xué)研究中的一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。在周?chē)窠?jīng)發(fā)生離斷性損傷時(shí),斷端遠(yuǎn)側(cè)部分和近側(cè)1-2個(gè)軸突和髓鞘發(fā)生一系列的分子和細(xì)胞學(xué)事件,即我們通常所說(shuō)的華勒變性,導(dǎo)致軸漿微管和神經(jīng)纖維管的連續(xù)性遭到破壞。24小時(shí)后斷端遠(yuǎn)側(cè)的軸突發(fā)生變性、解體；48小時(shí)后髓鞘開(kāi)始破壞。然后巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞遷移到變性神經(jīng)斷端附近清除髓鞘和軸突的殘?jiān)?與此同時(shí)雪旺細(xì)胞增殖形成Bunger帶。在雪旺細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)的影響下,損傷近端的神經(jīng)纖維芽生出一個(gè)被基底膜圍繞的再生單位。新的軸突芽生往往從朗飛氏結(jié)開(kāi)始并被雪旺細(xì)胞重新髓鞘化。功能性的支配需要再生的軸突在生長(zhǎng)圓錐的引導(dǎo)下延伸至突觸的終末器官,在人類,軸突再生速度約2-5mm/天,因此一些重大的損傷的恢復(fù)可能需要幾個(gè)月。為了幫助周?chē)窠?jīng)損傷的修復(fù),早在17世紀(jì)就進(jìn)行了臨床干預(yù)。到了19世紀(jì)和20世紀(jì),外科技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步,被廣泛地應(yīng)用于周?chē)窠?jīng)損傷的診療中。盡管在外周神經(jīng)損傷的外科修復(fù)取得了很大的進(jìn)步,但自體神經(jīng)的移植一直被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此,自體神經(jīng)移植也有自己的缺陷如：供體神經(jīng)的有限性,需要進(jìn)行二次手術(shù)等。另外,采用這種方法也僅能恢復(fù)原有功能的80%。因此尋找更有前途的方法是周?chē)窠?jīng)修復(fù)一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái),陸續(xù)出現(xiàn)了不同類型的生物或人工移植物,并不乏拿這些移植物與自體神經(jīng)移植進(jìn)行比較的研究。組織工程,作為一個(gè)新興的領(lǐng)域,這些年來(lái)蓬勃發(fā)展。這些給神經(jīng)科學(xué)家和外科醫(yī)生合作發(fā)展組織工程神經(jīng)移植物提供了契機(jī)。與其它組織工程產(chǎn)物類似,組織工程神經(jīng)移植物也是由物理支架并導(dǎo)入支持細(xì)胞和(或)生長(zhǎng)因子或其它的生物分子。 隨著周?chē)窠?jīng)修復(fù)中組織工程神經(jīng)移植物的應(yīng)用,周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的主要膠質(zhì)細(xì)胞即雪旺細(xì)胞也越來(lái)越受到重視。在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中,雪旺細(xì)胞沿著軸突生長(zhǎng)的方向遷移并在軸索的前方,首先包裹幾個(gè)軸突,最終僅僅包繞一個(gè)軸突節(jié)段。當(dāng)周?chē)窠?jīng)損傷時(shí),雪旺細(xì)胞增殖,產(chǎn)生生長(zhǎng)因子,清除殘?jiān)?并且為軸突的再生提供指引和支持。另外,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)平行排列的活體和離體雪旺細(xì)胞都能促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。因?yàn)樵谥車(chē)窠?jīng)損傷修復(fù)中的重要作用,雪旺細(xì)胞在治療中的作用越來(lái)越受到重視。最近已經(jīng)得到證實(shí),神經(jīng)組織工程移植物,特別是神經(jīng)誘導(dǎo)管道需要移植支持細(xì)胞如雪旺細(xì)胞才能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。 雪旺細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴,發(fā)育最終形成周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中形成髓鞘的雪旺細(xì)胞和無(wú)髓鞘形成雪旺細(xì)胞,分別包繞粗和細(xì)的軸突。在形成雪旺細(xì)胞之前,還經(jīng)過(guò)了另外兩種細(xì)胞類型,一種是雪旺細(xì)胞前體,這種細(xì)胞是14-15天胚胎鼠中的膠質(zhì)細(xì)胞類型；另一種是不成熟的雪旺細(xì)胞,這種細(xì)胞是由雪旺細(xì)胞前體產(chǎn)生的,是17-18天胚胎鼠(大約是出生時(shí))中的膠質(zhì)細(xì)胞類型。出生后的不成熟雪旺細(xì)胞發(fā)育主要跟它隨機(jī)包繞的軸突有關(guān)系,只有在包繞粗的軸突時(shí)才能形成髓鞘。整個(gè)發(fā)育過(guò)程可以分為三個(gè)階段：從神經(jīng)嵴干細(xì)胞到雪旺細(xì)胞前體；從雪旺細(xì)胞前體到不成熟的雪旺細(xì)胞；從不成熟的雪旺細(xì)胞到兩種成熟雪旺細(xì)胞類型。這一系列的過(guò)程都受到與細(xì)胞相聯(lián)系的軸突信號(hào)的調(diào)控。 體內(nèi)的細(xì)胞生活在一個(gè)復(fù)雜的微環(huán)境中,既受到化學(xué)因素也受到物理因素的影響,其中微環(huán)境中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)往往以物理因素的形式影響細(xì)胞行為。盡管在不同細(xì)胞系統(tǒng)生物化學(xué)的影響已經(jīng)得到詳盡的證實(shí),但我們對(duì)于物理因素怎樣影響細(xì)胞的行為尚處于懵懂狀態(tài)。1934年,Formalas發(fā)明了用靜電力制備聚合物纖維的實(shí)驗(yàn)裝置并申請(qǐng)了專利,其專利公布了聚合物溶液如何在電極間形成射流,這是首次詳細(xì)描述利用高壓靜電來(lái)制備纖維裝置的專利,被公認(rèn)為是靜電紡絲技術(shù)制備纖維的開(kāi)端。但該技術(shù)發(fā)展較緩慢,科研人員大多集中在靜電紡絲裝置的研究上,發(fā)布了一系列的專利,但是尚未引起廣泛的關(guān)注。直到近年來(lái),隨著納米技術(shù)的發(fā)展靜電紡絲技術(shù)獲得了快速發(fā)展,通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維材料是近十幾年來(lái)世界材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的最重要的學(xué)術(shù)與技術(shù)活動(dòng)之一。靜電紡絲并以其制造裝置簡(jiǎn)單、紡絲成本低廉、可紡物質(zhì)種類繁多、工藝可控等優(yōu)點(diǎn),已成為有效制備納米纖維材料的主要途徑之一。靜電紡絲因能模擬體內(nèi)微環(huán)境,因此被廣泛應(yīng)用于制造納米纖維支架。RSC96細(xì)胞株是大鼠雪旺細(xì)胞經(jīng)過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)自然轉(zhuǎn)化而成,是一種較理想的類Schwann細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)該細(xì)胞系和原代雪旺細(xì)胞的生物學(xué)性狀進(jìn)行了比較,然后在此研究基礎(chǔ)上以RSC96細(xì)胞為模型來(lái)探討靜電紡絲對(duì)RSC96細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。 目的： 1.對(duì)比了原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞與RSC96細(xì)胞生物學(xué)行為。 2.制備不同空間排列的靜電紡絲和粗細(xì)不同的平行靜電紡絲。 3.研究不同空間排列的靜電紡絲對(duì)RSC96細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 4.初步探索粗細(xì)不同的平行排列靜電紡絲對(duì)RSC96細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 方法 1.取1～3天齡SD乳鼠的雙側(cè)的坐骨、臂叢神經(jīng),D-Hank's液沖洗2次,解剖顯微鏡下仔細(xì)剝除神經(jīng)外膜,D-Hanks液反復(fù)沖洗2次,剪碎至1mm3大小的組織塊,雙酶消化法進(jìn)行分離培養(yǎng),阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),后加入含F(xiàn)orsoklin和牛腦垂體浸提物的培養(yǎng)液來(lái)選擇性促進(jìn)雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng),最后傳代進(jìn)一步純化,光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)RSC96細(xì)胞。隔天換液,待細(xì)胞融合率為80%時(shí)用胰蛋白酶消化傳代,光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。胰蛋白酶消化收集兩種細(xì)胞,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA。經(jīng)特定引物PCR擴(kuò)增,取相同量的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)；qPCR反應(yīng)采用SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2X),按照說(shuō)明書(shū)在冰上配制PCR反應(yīng)液,每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線,采用2-ΔΔcT法確定特定熒光域值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值,對(duì)目標(biāo)基因定量。2)按照細(xì)胞總蛋白分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分離提取各組細(xì)胞的蛋白。用Bradford Protein Assay Kit試劑盒測(cè)定蛋白含量。取等量樣品總蛋白與等體積2×SDS凝膠上樣緩沖液混勻,100℃加熱煮沸10min,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離。用濕電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,分別采用抗NGF,抗Laminin和抗(3-actin一抗孵育2h,三次洗膜后,加入HRP-偶聯(lián)二抗,進(jìn)行免疫反應(yīng),化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶。條帶信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析。 2.直徑較細(xì)的平行排列的靜電紡絲纖維制備：將6-氟異丙醇溶解的10%的聚己內(nèi)酯在電壓為10kv的靜電紡絲儀上以4m1/h速度紡成紡絲,用2800rpm的取向接收器接收。隨機(jī)排列的靜電紡絲纖維制備：將6-氟異丙醇溶解的10%的聚己內(nèi)酯在電壓為10kv的靜電紡絲儀上以3ml/h速度紡成紡絲,用200rpm接收器接收。在制備上述兩種不同空間排列的靜電紡絲時(shí),注射器噴頭和接收器之間的距離分別是15cm和13cm。直徑較粗的平行排列的靜電紡絲纖維制備：將二氯甲烷和甲醇混合液溶解的15%的聚己內(nèi)酯在電壓為10kv的靜電紡絲儀上以3m1/h速度紡成紡絲,用2800rpm的取向接收器接收。注射器噴頭和接收器之間的距離是10cm。 3.RSC96細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后24h換液,2-3d傳代擴(kuò)增,擴(kuò)增培養(yǎng)24小時(shí)后接種于PCL材料上,并進(jìn)行分組,對(duì)照組A：平行排列的靜電紡絲上接種培養(yǎng)RSC96細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組B：隨機(jī)排列的靜電紡絲上接種培養(yǎng)RSC96細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組C：PCL膜直接接種培養(yǎng)RSC96細(xì)胞。各組接種細(xì)胞數(shù)量相同。各組細(xì)胞于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天(期間換液1次)后,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1)按照細(xì)胞總蛋白分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分離提取各組細(xì)胞的蛋白。用Bradford Protein Assay Kit試劑盒測(cè)定蛋白含量。取等量樣品總蛋白與等體積2×SDS凝膠上樣緩沖液混勻,100℃加熱煮沸10min,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離。用濕電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,分別采用抗NGF,抗Laminin和抗β-actin一抗孵育2h,三次洗膜后,加入HRP--偶聯(lián)二抗,進(jìn)行免疫反應(yīng),化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)條帶。條帶信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析。2)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA。經(jīng)特定引物PCR擴(kuò)增,取相同量的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)；qPCR反應(yīng)采用S YBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2X),按照說(shuō)明書(shū)在冰上配制PCR反應(yīng)液,每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線,采用2-ΔΔCT法確定特定熒光域值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值,對(duì)目標(biāo)基因定量。 4.RSC96細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后24h換液,2-3d傳代擴(kuò)增,擴(kuò)增培養(yǎng)24小時(shí)后接種于PCL材料上,并進(jìn)行分組,對(duì)照組A：六孔板空白孔內(nèi)直接接種培養(yǎng)RSC96細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組B：直徑較細(xì)平行靜電紡絲上接種培養(yǎng)RSC96細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組C：直徑較粗平行靜電紡絲上接種培養(yǎng)RSC96細(xì)胞。各組接種細(xì)胞數(shù)量相同。各組細(xì)胞于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天(期間換液1次),用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA。經(jīng)特定引物PCR擴(kuò)增,取相同量的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)：qPCR反應(yīng)采用SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2X),按照說(shuō)明書(shū)在冰上配制PCR反應(yīng)液,每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線,采用2-ΔΔCT法確定特定熒光域值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值,對(duì)目標(biāo)基因定量。 結(jié)果 1.光鏡下觀察,雪旺細(xì)胞胞體呈雙極紡錘形,周緣有亮帶,胞核呈卵圓形或長(zhǎng)圓形,細(xì)胞兩極有長(zhǎng)短不等的突起,細(xì)胞間常有端對(duì)端、肩并肩排列,排列呈放射狀或巢狀；RSC96細(xì)胞呈現(xiàn)典型的雙極紡錘形或多角形,絕大多數(shù)細(xì)胞伸出長(zhǎng)突起,其生長(zhǎng)形態(tài)與原代雪旺細(xì)胞非常相似；qPCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的RSC96細(xì)胞也可表達(dá)NGF及Laminin,與原代雪旺細(xì)胞相似。 2.運(yùn)用不同靜電紡絲接收裝置,制備了直徑相似但空間排列不同的兩組靜電紡絲；通過(guò)對(duì)紡絲溶液濃度和毛細(xì)噴絲頭與接收儀器間距離的調(diào)控,制備了直徑不同但同為平行排列的兩組靜電紡絲。 3.平行、隨機(jī)靜電紡絲及膜上培養(yǎng)RSC96細(xì)胞NGF和Laminin基因的表達(dá)及蛋白含量：3組細(xì)胞培養(yǎng)3天,后兩組的RSC96細(xì)胞NGF基因的擴(kuò)增表達(dá)量較多,相比第一組有很明顯的差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),后兩組之間明顯差異；3組細(xì)胞均有Laminin基因擴(kuò)增表達(dá),且呈遞減趨勢(shì),各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各組細(xì)胞蛋白條帶顯示均有NGF和Laminin的表達(dá),其中各組NGF蛋白的表達(dá)明顯差異,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；各組Laminin蛋白的表達(dá)呈遞減趨勢(shì),各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4.培養(yǎng)在粗細(xì)不同的平行靜電紡絲上及空白對(duì)照組的RSC96細(xì)胞NGF和Laminin蛋白表達(dá)：3組細(xì)胞培養(yǎng)3天,后兩組的RSC96細(xì)胞NGF基因的擴(kuò)增表達(dá)量較少,相比第一組有很明顯的差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),后兩組之間無(wú)明顯差異(P0.05)；3組細(xì)胞均有Laminin基因擴(kuò)增表達(dá),且呈遞增趨勢(shì),各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的RSC96細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)與原代雪旺細(xì)胞非常相似；也可表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及層粘連蛋白,是一種較理想的原代雪旺細(xì)胞替代品,避免了長(zhǎng)周期且繁雜的原代雪旺細(xì)胞培養(yǎng)及雪旺細(xì)胞純度不高和長(zhǎng)期培養(yǎng)雪旺細(xì)胞功能不佳等不足。 2.通過(guò)控制靜電紡絲工藝中的相關(guān)因素如：紡絲溶液濃度、接收裝置不同及毛細(xì)噴絲頭與接收儀器間距離分別制備了兩種不同空間排列即平行和隨機(jī)排列的PCL靜電紡絲及粗細(xì)不同的平行的PCL靜電紡絲。 3.將RSC96細(xì)胞培養(yǎng)在不同空間排列的靜電紡絲上,檢測(cè)RSC96細(xì)胞神經(jīng)生長(zhǎng)因子及層粘連蛋白的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)平行排列的靜電紡絲纖維抑制神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá),卻促進(jìn)層粘連蛋白的表達(dá),從而進(jìn)一步說(shuō)明了平行排列的靜電紡絲纖維可能有類似與軸突的作用,并可能促進(jìn)RSC96細(xì)胞向更成熟的形態(tài)發(fā)育。 4.初步探討了將RSC96細(xì)胞培養(yǎng)在不同直徑的平行排列靜電紡絲上,檢測(cè)RSC96細(xì)胞NGF及Laminin基因表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)直徑較粗的平行靜電紡絲纖維Laminin的表達(dá)較多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R745

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 郭穎志;張慧芳;顧忠偉;;聚己內(nèi)酯-b-丙交酯共聚物微球免疫避孕體系的研究[J];中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志;2009年04期

2 黃勵(lì)中;林宗瓊;佘厚德;肖秀峰;劉榕芳;;殼聚糖-聚己內(nèi)酯復(fù)合膜的制備及其性能研究[J];膜科學(xué)與技術(shù);2008年06期

3 楊記,張佩華;幾種常用的可生物降解醫(yī)用材料[J];上海紡織科技;2001年04期

4 唐奚敏;張亞瓊;郭圣榮;;水作為有機(jī)相添加劑對(duì)牛血清白蛋白聚己內(nèi)酯微球的影響[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào);2009年07期

5 秦煜,顧立強(qiáng),裴國(guó)獻(xiàn),吳嵐曉;感覺(jué)神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)Schwann細(xì)胞的培養(yǎng)研究[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2002年03期

6 楊寒;程亮;郭圣榮;;5-氟尿嘧啶聚己內(nèi)酯針狀植入劑的研究[J];中國(guó)藥學(xué)雜志;2009年08期

7 汪小超;袁偉方;顧曉雯;段亞君;孔德領(lǐng);王連永;俞耀庭;;水滴為模板制備蜂窩狀表面的聚己內(nèi)酯多孔膜及其細(xì)胞親和性[J];中國(guó)科技論文在線;2010年04期

，

本文編號(hào)：1661853