本文選題：分子影像　切入點(diǎn)：炎癥　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：分子影像(Molecular Imaging)是指通過(guò)影像學(xué)的方法,無(wú)創(chuàng)性的檢測(cè)細(xì)胞和(或)分子水平的主要事件,了解體內(nèi)特異性基因或者蛋白表達(dá)部位、水平、分布及持續(xù)的時(shí)間。分子影像的發(fā)展主要依賴以下條件的發(fā)展：1.具有臨床意義的靶點(diǎn)；2.適合靶點(diǎn)的分子探針及適當(dāng)?shù)男盘?hào)放大機(jī)制；3.高敏感度及分辨率的成像設(shè)備或混合成像設(shè)備。分子影像的靶點(diǎn)需要是機(jī)體有意義的生理及病理情況下大量表達(dá)的某種物質(zhì)。神經(jīng)炎癥由于參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,一直是分子影像靶點(diǎn)探索和成像研究的熱點(diǎn)之一。神經(jīng)炎癥是指神經(jīng)系統(tǒng)在感染,創(chuàng)傷,中毒或自身免疫啟動(dòng)等情況下,循環(huán)的外周免疫細(xì)胞跨越抵抗力減弱的血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB),釋放多種酶來(lái)誘導(dǎo)并參與的炎癥過(guò)程。髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)是參與炎癥反應(yīng)的酶中比較關(guān)鍵的一種,是許多活化了的白細(xì)胞強(qiáng)有力的炎性介質(zhì)。MPO以氯離子和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫為底物,催化產(chǎn)生次氯酸和多種自由基。如果機(jī)體不能有效清除這些氧化劑和自由基,便引起多種病理過(guò)程和組織損傷。因此,MPO的活性可以反映神經(jīng)炎癥活動(dòng)性,可以作為示蹤神經(jīng)炎癥參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病活動(dòng)性的成像靶點(diǎn)。分子探針是指底物與能產(chǎn)生影像學(xué)信號(hào)的物質(zhì)以特定方法結(jié)合而構(gòu)成的一種復(fù)合物。目前,分子探針大多為靶向性探針,利用特異性探針與靶目標(biāo)結(jié)合而成像,主要用于感興趣分子的在體分布情況的顯示。其中,可激活的探針,又稱為智能探針,由于探測(cè)或參與特異的分子事件并被激活而成像,對(duì)分子事件具有很好的特異性,并達(dá)到對(duì)靶事件的功能性顯示。對(duì)于探針的檢測(cè),各種設(shè)備各有利弊。磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)具有很高的空間分辨率,適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的探索,但其檢測(cè)敏感性較低,需要大量對(duì)比劑在靶組織內(nèi)聚集及強(qiáng)大的信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)。與此相比,光學(xué)分子成像具有敏感性高、可實(shí)時(shí)成像等優(yōu)點(diǎn),且無(wú)創(chuàng)傷、價(jià)格低,可對(duì)磁共振成像信息進(jìn)行補(bǔ)充。本研究擬以神經(jīng)炎癥中的關(guān)鍵酶MPO為靶點(diǎn),構(gòu)建MPO可特異性激活的磁共振智能探針及熒光智能探針,并對(duì)其在示蹤中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)性炎性病灶的應(yīng)用進(jìn)行研究。且擬利用熒光成像對(duì)淋巴細(xì)胞的進(jìn)行體外示蹤初步探討,為多模態(tài)成像奠定基礎(chǔ)。第一部分靶向MPO的磁共振成像評(píng)估多發(fā)性硬化聯(lián)合治療的動(dòng)物模型研究目的：醋酸格拉默(Glatiramer acetate, GA)通過(guò)產(chǎn)生免疫抑制性Th2淋巴細(xì)胞被用于治療MS; 4-Aminobenzoic acid hydrazide (ABAH)是一種特異性MPO酶活性抑制劑。本研究擬以MPO為靶點(diǎn),通過(guò)MPO特異性分子探針磁共振成像評(píng)估兩種藥物聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)動(dòng)物模型的療效。材料與方法：SJL小鼠皮下注射髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(Proteolipidprotein, PLP)誘導(dǎo)EAE模型小鼠110只。記誘導(dǎo)當(dāng)天為第0天,急性期為第10天,追蹤至第20天。小鼠隨機(jī)分為4組,生理鹽水對(duì)照組200 μL, bid (n= 5), ABAH組20mg/kg, bid (n= 30), GA 75μg, qd組 (n=30)及ABAH 20mg/kg, bid及GA75μg,qd聯(lián)合治療組(n=40)。5只假手術(shù)小鼠經(jīng)同樣方式誘導(dǎo),但用PBS代替PLP。每天2次進(jìn)行臨床評(píng)分評(píng)估,并觀察小鼠生存率。合成MPO可特異性激活的智能探針bis-5HT-DTPA-Gd (MPO-Gd),選擇急性期不同治療組小鼠行磁共振T1WI平掃及增強(qiáng)掃描。結(jié)合平掃及增強(qiáng)后60min圖像分析病灶的數(shù)目,病灶體積及病灶對(duì)比噪聲比。成像小鼠行HE,抗MPO及堅(jiān)考藍(lán)染色,評(píng)估病灶的炎性浸潤(rùn),MPO表達(dá)及脫髓鞘程度。統(tǒng)計(jì)采用Student's t-test, P0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果：EAE小鼠模型誘導(dǎo)成功。觀察至急性期,可見聯(lián)合治療組小鼠發(fā)病晚,且疾病嚴(yán)重程度明顯輕于單藥治療組(ABAH P0.001, GA P0.05)。觀察至第20天,綜合整個(gè)疾病進(jìn)程,聯(lián)合治療組臨床評(píng)分低,且疾病嚴(yán)重程度明顯輕于單藥治療組(ABAH P0.05, GA P0.05),生存率也高。在急性期成像,分析不同治療組小鼠的平掃及MPO-Gd增強(qiáng)6Omin影像結(jié)果顯示,聯(lián)合治療組的病灶數(shù)目減少(ABAH P0.01, GA P0.05),病灶的體積明顯減小(ABAH P0.05,GAP0.05)；對(duì)比噪聲比也明顯減低(ABAH P0.01, GA P0.05)。病理結(jié)果同樣顯示聯(lián)合治療組腦內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),MPO的表達(dá)及髓鞘破壞的程度均減低。結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GA與ABAH低劑量聯(lián)合治療較單藥治療效果好。以MPO為靶點(diǎn)的MPO-Gd智能探針MR成像通過(guò)示蹤腦內(nèi)活動(dòng)性病灶,準(zhǔn)確反映這一療效,同臨床表現(xiàn)及病理結(jié)果相符。第二部分髓過(guò)氧化物酶特異性熒光探針的特性探索及初步應(yīng)用目的：基于MPO-Gd分子探針合成原理,為擴(kuò)展MPO為靶點(diǎn)的分子成像應(yīng)用范圍,本實(shí)驗(yàn)擬合成一種MPO可激活的酶活性智能熒光探針,并對(duì)其在體內(nèi)外靶向炎性病變的特性及應(yīng)用進(jìn)行初步探索。材料與方法：以5-羥色胺(5-Hydroxy tryptmamine,5-HT)為底物,接以生物素基團(tuán)合成MPO可激活的熒光探針,進(jìn)而通過(guò)接以熒光基團(tuán)的鏈酶親和素同探針中生物素的特異性結(jié)合對(duì)MPO進(jìn)行成像。體外,包埋及未包埋人MPO的基質(zhì)膠鋪于96孔板中,按順序分別加入熒光探針,清洗；加入不同濃度鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物,清洗,對(duì)基質(zhì)膠行熒光成像。在體,將包埋不同濃度人MPO的基質(zhì)膠注入小鼠皮下,并尾靜脈分別注入MPO探針及鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物。肺炎鏈球菌皮下注射制作小鼠皮下細(xì)菌感染模型,同樣經(jīng)尾靜脈注入MPO探針和鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物,并皮下注入Sytox Green綠色熒光蛋白來(lái)檢測(cè)局部炎性粒細(xì)胞凋亡情況。以上動(dòng)物模型分別在注入熒光探針后0,15,30,45,60min行熒光成像。沙門氏桿菌脊髓鞘內(nèi)注射制作小鼠腦膜炎感染模型,分離腦單個(gè)核細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)分析腦內(nèi)髓系細(xì)胞浸潤(rùn)情況,并取腦組織分析MPO活性。同樣尾靜脈注入MPO探針和鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物,60min后取腦組織,離體熒光成像。結(jié)果：MPO特異性熒光探針可以成功合成。體外基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)熒光成像可見MPO陰性的基質(zhì)膠熒光成像為陰性,而MPO陽(yáng)性的基質(zhì)膠內(nèi)各孔可見熒光強(qiáng)度升高,且升高程度同鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物的濃度趨勢(shì)相同。說(shuō)明MPO探針可被激活并發(fā)生局部寡聚化,且生物素-鏈酶親和素兩步法熒光成像可行。小鼠皮下包埋MPO基質(zhì)膠成像可見MPO陽(yáng)性基質(zhì)膠部位熒光強(qiáng)度明顯升高,且信號(hào)的強(qiáng)度升高趨勢(shì)同MPO濃度升高趨勢(shì)相關(guān)(r2=0.9572)。肺炎鏈球菌皮下感染小鼠的60min熒光成像可見MPO探針可靶向聚集到感染部位,呈現(xiàn)紅色熒光,同局部凋亡中性粒細(xì)胞的綠色熒光相吻合,說(shuō)明局部激活的炎性細(xì)胞凋亡,釋放MPO并可被MPO熒光探針檢測(cè)到。鞘內(nèi)注射沙門氏桿菌的腦膜炎小鼠造模后24小時(shí),流式細(xì)胞術(shù)分析可見腦內(nèi)存在大量髓系細(xì)胞的浸潤(rùn)。病變腦MPO活性結(jié)果顯示腦膜炎小鼠腦內(nèi)MPO活性明顯升高,說(shuō)明腦膜炎小鼠建模成功。模型小鼠腦組織離體熒光成像可見病變腦膜呈明顯條狀強(qiáng)化,而正常鼠腦未出現(xiàn)此強(qiáng)化。說(shuō)明MPO探針可跨越血腦屏障,為中樞的MPO激活而顯像。結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)中,我們成功合成一種新的MPO可以激活的酶活性熒光探針,其同鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物兩步法成像可行。體外及在體(中樞及外周)熒光成像表明此探針可特異性靶向MPO存在部位,進(jìn)而對(duì)活動(dòng)性炎性病灶成像。第三部分 熒光示蹤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫治療膠質(zhì)瘤初探目的：利用熒光成像的高敏感性優(yōu)勢(shì),本研究擬通過(guò)對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞表面生物素化,通過(guò)鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物間接對(duì)T淋巴細(xì)胞靶向生物素化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行體外熒光示蹤,并對(duì)其特異性靶向殺傷作用進(jìn)行初步探索。材料與方法：小鼠脾臟陽(yáng)性選擇分離CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞并刺激增殖1-2天,得到激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。慢病毒轉(zhuǎn)染法激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行生物素化并分析轉(zhuǎn)染效率。Sulfo-NHS-生物素對(duì)激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行表面蛋白共價(jià)結(jié)合法生物素化,并分析至72小時(shí)時(shí)的標(biāo)記效率及T淋巴細(xì)胞存活率。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方法對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面生物素化,并生物熒光素酶轉(zhuǎn)染觀察熒光素酶分泌情況。將生物素化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞同激活的T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)24小時(shí),觀察殺傷效果。統(tǒng)計(jì)學(xué)采用Student's t-test, P0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果：慢病毒轉(zhuǎn)染法生物素化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞效率較低(15.50±3.027%),且細(xì)胞損傷嚴(yán)重。而共價(jià)結(jié)合細(xì)胞表面生物素化的方法可以對(duì)激活的T淋巴細(xì)胞高效標(biāo)記(98.36±0.6129%)。體外通過(guò)流式分析術(shù)可以敏銳檢測(cè)到標(biāo)記以鏈酶親和素?zé)晒馓结樀募せ畹腡淋巴細(xì)胞,且檢測(cè)到生物素化的T淋巴細(xì)胞72小時(shí)以內(nèi)活性不受影響并細(xì)胞標(biāo)記不丟失。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可以被慢病毒成功轉(zhuǎn)染,細(xì)胞表面表達(dá)生物素效率較高,且細(xì)胞存活良好。體外T淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果表明以鏈酶親和素為橋梁的靶向組T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤效果最好,腫瘤形態(tài)發(fā)生明顯改變,腫瘤表達(dá)熒光量降低,且可見標(biāo)記以熒光探針的T淋巴細(xì)胞聚集于腫瘤群落周圍。利用生物熒光素酶檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)分泌情況發(fā)現(xiàn),相對(duì)于對(duì)照組及非靶向組,靶向組腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制(對(duì)照組P0.001；非靶向組P0.01)結(jié)論：本研究中利用共價(jià)結(jié)合表面生物素化并鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞靶向生物素化膠質(zhì)瘤的體外熒光示蹤。鏈酶親和素增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)生物素化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的靶向及殺傷作用。展望：實(shí)現(xiàn)MRI同熒光成像結(jié)合的雙模態(tài)成像。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫治療膠質(zhì)瘤中細(xì)胞示蹤并復(fù)雜腫瘤免疫微環(huán)境的監(jiān)測(cè),可通過(guò)細(xì)胞表面熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞體內(nèi)熒光示蹤；結(jié)合MPO-Gd增強(qiáng)圖像來(lái)評(píng)價(jià)T淋巴細(xì)胞免疫治療后膠質(zhì)瘤周圍炎性免疫微環(huán)境的變化,綜合評(píng)價(jià)免疫治療的療效并進(jìn)行機(jī)制研究�？傊�,本研究中,我們合成了MPO特異性磁共振智能探針和熒光智能探針；通過(guò)MPO可激活的智能探針,將MPO作為一個(gè)敏感的成像靶點(diǎn)對(duì)中樞及外周的活動(dòng)性炎性病灶成像可行；通過(guò)T淋巴細(xì)胞表面生物素化,借助鏈酶親和素?zé)晒鈴?fù)合物實(shí)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞靶向生物素化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外熒光示蹤并監(jiān)測(cè)殺傷效果；為多模態(tài)成像評(píng)估復(fù)雜生物分子事件奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741;R445.2

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本文編號(hào)：1661525