本文選題：內(nèi)側(cè)顳葉癲癇　切入點：發(fā)病機制　出處：《中南大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景與目的： 癲癇是目前世界第三大慢性腦性疾病,亦是小兒神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy, MTLE)是其重要的亞型,是目前公認(rèn)的難治性癲癇之一,以海馬硬化為其突出的臨床病理特征。目前對于藥物難治性MTLE的治療主要是手術(shù)切除硬化的病變海馬,進而控制癲癇發(fā)作,減少驚厥給大腦造成的損害,但是一部分接受海馬切除的患者,仍然有驚厥的反復(fù)發(fā)作,這提示,海馬硬化并不是引起患者抽搐最根本的原因,癲癇的慢性自發(fā)發(fā)作還有更為根本的原因未被人類所認(rèn)識。正因為缺乏對MTLE發(fā)病機制的了解,目前MTLE主要的治療方法還是在手術(shù)切除硬化海馬的基礎(chǔ)上,使用促細(xì)胞膜穩(wěn)定的抗癲癇藥物,通過減少神經(jīng)元異常放電,而控制驚厥發(fā)作,但針對癲癇病因及發(fā)病機制的治療甚少。 兒童時期的癲癇以及癲癇綜合征與成年期有很大不同。在不成熟大腦中,由于大腦及突觸的快速發(fā)育,使得癲癇發(fā)生的敏感性達到峰值。雖然癲癇可以在任何年齡發(fā)生,但最初的致癇損傷多發(fā)生于生后不久以及幼年時期,因為此時神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不成熟,易受異常代謝、創(chuàng)傷、基因突變等有害因素影響,為癲癇慢性形成埋下種子。而這些有害因素影響機體時,機體神經(jīng)系統(tǒng)所處的成熟階段,也是決定癲癇發(fā)作閾值和發(fā)作類型的關(guān)鍵因素。近二十年的研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)激活、過度的炎癥反應(yīng)在癲癇慢性自發(fā)發(fā)作過程中起著持續(xù)而重要的作用,而在發(fā)育中的大腦,與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的炎癥反應(yīng)能增加癲癇發(fā)作頻率以及大腦對癲癇的敏感程度,增加癲癇的易感性。因此,了解炎癥與癲癇發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,對于MTLE發(fā)病機制研究有著重要意義。 髓樣受體蛋白8(Myoloid-Related Protein8, MRP8)是近年炎癥研究領(lǐng)域逐漸被關(guān)注的新星,它是S100家族的一員,在炎癥過程中表達于激活的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,并被認(rèn)為是多種炎癥相關(guān)性疾病中的前炎癥標(biāo)志蛋白。促炎因子白介素-1β (interleukin-1β, IL-1p)在癲癇患者及癲癇模型鼠的海馬內(nèi)均有高表達,并被認(rèn)為在癲癇進展過程中起重要作用。IL-1p可由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte, AS)誘導(dǎo)產(chǎn)生,繼而誘發(fā)下游的炎癥瀑布反應(yīng)。而這種持續(xù)炎癥反應(yīng)的存在,對癲癇向慢性自發(fā)發(fā)作轉(zhuǎn)變,起著重要作用。然而,什么因素導(dǎo)致AS活化進而分泌IL-1p引發(fā)炎癥反應(yīng)?MRP8是否與IL-1p分泌有關(guān)?IL-1p通過什么途徑促進MTLE進展呢?目前未見詳細(xì)報道。本研究立足于炎癥與MTLE發(fā)病機制的相關(guān)性研究,嘗試從炎癥來源以及炎癥促MTLE進展的作用機制入手,尋找MTLE慢性自發(fā)發(fā)作的可能原因,以期為今后通過干預(yù)發(fā)病機制減緩或阻斷難治性MTLE慢性進程、改善MTLE預(yù)后提供新視角。 研究方法： 本研究分為三部分： 1.以25日齡Sprague-Dawley (SD)大鼠為實驗對象,用匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)實驗鼠癲癇發(fā)作,制作MTLE大鼠模型。致癇后連續(xù)觀察8周,有癲癇自發(fā)發(fā)作的模型鼠被納入實驗,并對納入的模型進行鑒定,鑒定內(nèi)容包括：模型鼠行為學(xué)改變、腦電圖(Electroencephalography, EEG)改變,尼氏染色觀察神經(jīng)元丟失情況,以及Timm染色觀察海馬神經(jīng)元苔蘚樣出芽等；無菌條件下取新生48h內(nèi)SD鼠大腦,分離大腦皮層和海馬分別用于星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte, AS)和神經(jīng)元的培養(yǎng)。利用胰酶消化法獲得單細(xì)胞懸液,經(jīng)重復(fù)傳代,獲得體外培養(yǎng)的高純度原代AS；利用差率貼壁和神經(jīng)元培養(yǎng)專用Neurobasal+Glutmax+B27無血清培基培養(yǎng),獲得體外培養(yǎng)的高純度原代海馬神經(jīng)元。分別用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Portein, GFAP)和微管結(jié)合蛋白2(Microtubule Associated Protein2, MAP2)進行AS及神經(jīng)元鑒定。 2.運用免疫印跡(Western Blot, WB)、熒光定量RT-PCR (Real time quantitative RT-PCR, qPCR)、電泳遷移率變動分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、免疫組織化學(xué)(Immunological Histological Chemistry, IHC)、間接熒光免疫雙標(biāo)法等實驗方法檢測MTLE患者及MTLE模型鼠海馬組織內(nèi)髓樣相關(guān)蛋白(Myoloid-Related Protein8, MRP8)、Toll樣受體-4(Toll-like receptor4,TLR4)、核因子-kappa B (Nuclear factor-kappa B, NF-κB)以及IL-1β的表達變化。利用MRP8刺激體外培養(yǎng)的AS,運用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染發(fā)卡樣小干擾RNA (Hairpin siRNA, shRNA)使TLR4沉默、二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)預(yù)處理阻斷NF-κB,檢測TLR4、NF-κB以及IL-1p的表達變化及相互作用關(guān)系。 3.運用WB、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)、FM4-64熒光標(biāo)記等方法檢測MTLE患者及MTLE模型鼠海馬組織內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶-p85亞基(Phosphatidyl Inositol3-kinase-p85, PI3K-p85)、磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase, Akt)、磷酸化的靶蛋白核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6kinase, p70S6k)以及與白介素-1受體(Interleukin-1receptor, IL-1RI)結(jié)合的PI3k-p85的表達變化,并運用IL-1p刺激體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元,運用慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA使PI3K-p85沉默、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白((Mammalian Target Of Rapamycin, mTOR)抑制劑Rapamycin預(yù)處理阻斷mTOR、PP2抑制p85向IL-1RI募集等方式預(yù)處理神經(jīng)元,檢測PI3K-p85、與IL-1RI結(jié)合的PI3k-p85、p-Akt、p-p70S6k以及MAP2在神經(jīng)元內(nèi)的表達變化及相互作用關(guān)系；利用FM4-64染色觀察各組神經(jīng)元突觸胞吞情況。 研究結(jié)果： 1.匹羅卡品腹腔注射可以誘導(dǎo)SD模型鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作及癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE),并經(jīng)過一段無驚厥發(fā)作的潛伏期后,模型鼠出現(xiàn)癲癇慢性自發(fā)發(fā)作。EEG呈現(xiàn)典型癲癇樣放電；尼氏染色顯示在急性期CA1區(qū)和慢性期CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)有神經(jīng)元脫失以及變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生(與對照組比較,P0.05); Timm染色顯示慢性期模型鼠海馬組織CA3區(qū)及門齒區(qū)可見異常苔蘚纖維出芽,異常興奮環(huán)路形成(與對照組比較,p0.05)。體外培養(yǎng)的AS經(jīng)GFAP鑒定,純度在98%以上；體外培養(yǎng)的神經(jīng)元,經(jīng)MAP2鑒定,純度在95%以上。 2.發(fā)現(xiàn)MTLE患者海馬組織內(nèi)MRP8、TLR4、NF-κB以及IL-1β的表達增加(與對照組比較,P0.05)。MTLE大鼠海馬內(nèi)MRP8、TLR4、NF-κB以及IL-1p在急性期和慢性期表達增加(與對照組比較,p0.05),而潛伏期表達僅輕微增加(與對照組比較,p0.05)。利用MRP8刺激體外培養(yǎng)的AS,細(xì)胞內(nèi)的TLR4、NF-κB以及IL-1p表達增加(與對照組比較,p0.05),并且NF-κB由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,IL-1β在細(xì)胞上清液中含量增加(與對照組比較,p0.05)；抑制TLR4可以下調(diào)MRP8所致的NF-κB和IL-1p表達增加(與MRP8組比較,p0.05)以及NF-κB向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移；抑制NF-κB只能下調(diào)MRP8所致的IL-1p表達增加(與MRP8組比較,p0.05)。 3.發(fā)現(xiàn)MTLE患者海馬組織內(nèi)PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6k以及與IL-1RI結(jié)合的PI3K-p85表達增加(與對照組比較,p0.05)。MTLE模型鼠海馬內(nèi)上述蛋白在急性期、潛伏期和慢性期表達均增加(與對照組比較,p0.05)。利用IL-1p刺激體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,細(xì)胞內(nèi)PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6k、MAP2以及與IL-1RI結(jié)合的PI3K-p85表達均增加(與對照組比較,p0.05),并且神經(jīng)元突觸的胞吞作用明顯加劇(與對照組比較,p0.05)；抑制PI3K-p85可以下調(diào)IL-1β所致的p-Akt、p-p70S6k(?)口MAP2表達增加(與IL-1p組比較,p0.05),神經(jīng)元突觸的胞吞作用減弱(與IL-1β組比較,p0.05)；抑制mTOR也能下調(diào)IL-1β所致的PI3K-p85、p-Akt、p-P70S6K和MAP2表達增加(與IL-1β組比較,p0.05),神經(jīng)元突觸的胞吞作用減弱(與IL-1β組比較,p0.05)；抑制p85亞基與IL-1RI的結(jié)合也可以下調(diào)IL-1β所致的p-Akt、p-P70S6K和MAP2表達增加(與IL-1β組比較,p0.05)。 研究結(jié)論： 1.成功誘導(dǎo)出具有慢性自發(fā)發(fā)作的幼鼠MTLE模型,并在體外培養(yǎng)出了高純度的原代AS和原代海馬神經(jīng)元。 2.炎性標(biāo)志物MRP8通過TLR4/NF-κB/IL-1β信號途徑開啟了MTLE發(fā)病過程中促炎因子釋放的進程。 3.促炎因子IL-1β通過IL-1RI與PI3K-p85結(jié)合使PI3K-p85活化,進而磷酸化Akt和mTOR下游物質(zhì)p70S6k,促進神經(jīng)元突觸增生及活化,這可能是MTLE向慢性化進展的機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

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本文編號：1649493